13 с дыхательный уреазный тест: 13С-уреазный дыхательный тест на определение Helicobacter pylori

Содержание

13С-уреазный дыхательный тест на определение Helicobacter pylori

13С-уреазный дыхательный тест на определение Helicobacter pylori – методика лабораторной диагностики инфекции, вызванной Helicobacter pylori, основанная на анализе в пробах выдыхаемого воздуха специального реагента, содержание которого изменяется под действием выделяемого бактерией фермента уреазы.

Helicobacter pylori – грамотрицательная бактерия спиралевидной формы, которая обнаруживается в различных областях желудка и двенадцатиперстной кишки человека.

Helicobacter pylori способна выживать в агрессивной кислой среде желудка, в том числе из-за интенсивной продукции специального фермента – уреазы. Уреаза расщепляет мочевину с образованием аммиака, который нейтрализует соляную кислоту желудочного сока и таким образом обеспечивает поддержание комфортного для бактерии уровня кислотности (рН).

Описание:

Среди диагностических методик определения инфицированности Helicobacter pylori в последнее время всё чаще применяется уреазный дыхательный тест.

Это неинвазивное исследование (то есть без фиброгастроскопии и биопсии слизистой желудка), основанное на способности бактерии секретировать уреазу. Основным реагентом в данном тесте является 13С-мочевина, в которой 12С-атом углерода заменён на 13С-изотоп. При наличии в желудке Helicobacter pylori продуцируемая бактерией уреаза расщепляет поступившую в желудок с тестовым раствором 13С-мочевину на аммиак и 13С-углекислый газ, который затем всасывается в кровь, попадает в лёгкие и выводится с выдыхаемым воздухом.

Непосредственно перед исследованием пациенту необходимо выпить 200 мл апельсинового или грейпфрутового сока, чтобы замедлить эвакуацию из желудка. Через 5-10 минут производится взятие контрольной пробы воздуха – пациент делает выдох в специальный герметичный пакет, который затем закрывается и маркируется соответствующим образом. Для обеспечения точности теста особенно важно выдыхать последнюю (альвеолярную) часть воздуха. Затем пациенту дают выпить 50 мл раствора мочевины, меченной изотопом углерода 13С.

Это раствор без вкуса и запаха, его прием не сопровождается никакими неприятными ощущениями. Раствор готовится непосредственно перед приемом, его необходимо выпить в течение пяти минут после приготовления. Взрослые выпивают приготовленный раствор полностью (50 мл), а дети от 5 до 12 лет – половину. Затем в течение получаса следует находиться в спокойном состоянии, чтобы на результаты исследования не повлиял углекислый газ, выделяющийся при физической нагрузке. Через 30 минут производится взятие второй пробы воздуха, пакет с которой также герметично закрывается и маркируется. Затем пробы воздуха анализируют на инфракрасном спектрометре для определения изотопного соотношения 13С/12С. Если пациент инфицирован Helicobacter pylori, то во второй пробе воздуха появится увеличенное количество 13 СО2 по сравнению с его содержанием в первой (контрольной) пробе.

Подготовка:

Исключить из рациона алкоголь в течение 72 часов до исследования.

Не принимать пищу в течение 6 часов до исследования, можно пить чистую негазированную воду.

Исследование проводится не ранее чем через 6 недель после окончания последнего приема антибиотиков (по любому поводу) и препаратов висмута.

За две недели до проведения исследования необходимо прекратить (по согласованию с врачом) прием ингибиторов протонной помпы (омепразол, рабепразол, лансопразол, эзомепразол, пантопразол) и блокаторов гистаминовых рецепторов второго типа (ранитидин, фамотидин, низатидин, роксатидин).

Исследование проводится не менее чем через сутки после выполнения фиброгастроскопии (ФГДС) или до её проведения.

 

Литература

Гастроэнтерология: национальное руководство. Под ред. В. Т. Ивашкина, Т. Л. Лапиной. — М. : ГЭОТАР-Медиа, 2008. С. 432.

Дыхательный тест на хеликобактер — Цены на хелик-тест в Москве

По последним данным гастроэнтерологов, у 80% жителей России в организме присутствует бактерия Helicobacter Pylori. Эта неприметная бактерия является виновником развития у человека хронического антрального атрофического гастрита, хронического эрозивного гастродуоденита, язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки. И, что самое опасное, присутствие в организме хеликобактерной инфекции может являться причиной возникновения рака желудка, причем происходит это вне зависимости от возраста пациента.

Хеликобактерная инфекция коварна еще и тем, что передается от человека к человеку настолько легко, что опасность заражения существует даже при обычных бытовых контактах.

Для диагностики хеликобактерной инфекции в МЦ «Доктор 2000» применяется быстрый уреазный дыхательный хелик-тест.

Для диагностики хеликобактерной инфекции в МЦ «Доктор 2000» применяется быстрый уреазный дыхательный хелик-тест.

ХЕЛИК-тест – это метод неинвазивной дыхательной диагностики инфекции хеликобактер пилори (Helicobacter pylori).

Дыхательный тест ХЕЛИК предназначен для первичной диагностики хеликобактер пилори, а также для контроля хода антихеликобактерной терапии и проверки эффективности уже проведенной терапии.

Принцип действия ХЕЛИК-теста основан на биохимическом методе определения инфицированности бактерией хеликобактер пилори по ее уреазной активности, т. е. по способности гидролизовать карбамид. Пациент принимает раствор карбамида, и образующийся в ходе гидролиза газ поступает в воздух ротовой полости. Нагрузочный метод основан на сравнении уровня содержания газа, образующегося в ходе гидролиза карбамида (нагрузки), с базальным, исходным уровнем содержания этого газа. Для каждого пациента сравнивается его базальный уровень с его же нагрузочным уровнем, за счет чего метод ХЕЛИК и обеспечивает высокую точность диагностики Helicobacter pylori.

Преимущество дыхательного хелик-теста на хеликобактер в том, что:

  • ХЕЛИК-тест реализован в компактных и переносных тест-системах;
  • ХЕЛИК-тест безопасен даже для маленьких детей и беременных женщин, поскольку используется карбамид нормального изотопного состава, в отличие от других тестов;
  • ХЕЛИК-тест позволяет получить результат сразу по окончании обследования, в отличие от других дыхательных тестов, где приходится ждать, пока придут результаты проб;
  • результаты ХЕЛИК-теста не зависят от возраста и физической активности пациента, в отличие от углеродных дыхательных тестов 13С или 14С;
  • ХЕЛИК-тест доступнее в цене, карбамид (он же мочевина) нормального изотопного состава значительно дешевле, чем меченая мочевина для UBT-теста с 13С или 14С;
  • тест-системы ХЕЛИК производятся в России с 1997 года и применяются уже более чем в 400 российских городах.

По результатам обследования гастроэнтерологом каждому больному подбирается индивидуальная схема лечения, которая, помимо блокаторов кислотности желудка, включает в себя специфические антибиотики, подобранные с учетом активности бактерий на стенке слизистой оболочки желудка, что позволяет добиться эрадикации (уничтожения) бактерий в 90–95% случаев уже после проведения первого курса лечения!

Подбор схем производится с учетом личностной переносимости лекарств, с учетом минимально возможного количества осложнений в процессе приема препаратов и, что немаловажно, с учетом минимизации стоимости лечения.

Дыхательный тест на хеликобактер пилори

В медицинском центре «Династия» вы можете выполнить дыхательный тест на хеликобактер пилори и проконсультироваться с грамотным гастроэнтерологом. Наши специалисты расшифруют результаты обследования и определят дальнейшую тактику.

Helicobacter pylori — бактерия, которая поражает желудок и 12-перстную кишку. Благодаря своей спиралевидной форме и жгутикам, бактерия с легкостью проникает в слизистую, а продукты ее жизнедеятельности приводят к хроническому воспалению, не заживающим изъязвлениям.

Для диагностики хеликобактер пилори в организме используют несколько методов:

  • Анализ венозной крови на антитела — малоинформативный метод, т.к. наличие антител свидетельствует о контакте организма с инфекцией, но не показывают точно, была у вас инфекция ранее или она есть сейчас. Этот метод используется редко в связи с большим выбором более эффективных;
  • 13С-Urea Breath test-достоверный тест на хеликобактер пилори, с помощью которого можно определить бактерию в ЖКТ по выдыхаемому воздуху;
  • Аппаратный дыхательный тест — высокоинформативное экспресс исследование;
  • Биопсия при ФГДС-инвазивный метод диагностики. Биоптат исследуется на наличие бактерии.

Что такое дыхательный тест на хеликобактер?

13С-УДТ-достоверный метод диагностики, позволяющий обнаружить H. pylori в организме без инвазивного вмешательства. Основа этого метода-исследование газов в выдыхаемом воздухе.

Аппаратный дыхательный тест-быстрый, безопасный, имеет высокую степень доказательности при правильной подготовке. Для проведения этого метода используется одноразовая трубочка с тест-системой. Заключение вы получите сразу по окончании исследования.

Эти методы широко используется как для первичного обнаружения хеликобактер пилори, так и для подтверждения положительного результата лечения.

Н.pylori в процессе своей жизнедеятельности выделяет уреазу. При дыхательном тесте пациент выпивает меченый карбамид. При взаимодействии меченого карбамида и уреазы выделяется газ с меченым ионом углерода (13С), который мы отслеживаем в выдыхаемом пациентом воздухе и на основании этого можно судить о наличии данной бактерии в организме.

Кому нужно сделать тест на хеликобактер?

Специалисты выделяют несколько групп пациентов, которым рекомендовано сделать тест:

  • Пациентам, с уже имеющимся диагнозом гастрит, язва желудка, дуоденит, язва 12-перстной кишки, анемия;
  • Пациентам, если у их родственников был выявлен хеликобактер;
  • Пациентам с жалобами на изжогу, отрыжку, боли в животе, вздутие, неприятный запах изо рта.

Если вам подходит хоть один из перечисленных пунктов, мы рекомендуем Вам сдать тест на хеликобактер. Высококвалифицированные гастроэнтерологи ждут Вас в нашем медицинском центре и всегда готовы Вам помочь.

Цена дыхательного теста на хеликобактер пилори невысока.Мы стараемся делать стоимость услуг доступной,а качество высоким.

Как подготовиться к дыхательному тесту?

Чтобы С-13 уреазный дыхательный тест показал достоверный результат, перед исследованием необходимо соблюсти несколько правил:

  • Хелик-тест сдаётся обязательно утром натощак;
  • Промежуток между последним приемом пищи и тестом должен составлять не менее 8 часов;
  • Последний приём пищи не должен содержать тяжелую пищу и бобовые;
  • Не стоит употреблять алкоголь в течение 3 дней перед тестом;
  • После приема антибактериальной терапии должно пройти не менее 4 недель;
  • Перед тестом необходимо почистить зубы и прополоскать рот;
  • Необходимо исключить курение в течение 3 часов до теста.

Подготовка не требует глобальных усилий, но ее отсутствие значительно влияет на результат исследования.

Если вы не выполнили вышеуказанные правила, предупредите об этом своего доктора и вам перенесут исследование на другой день.

Как проходит аппаратный дыхательный тест на helicobacter pylori?

  • В нашем медцентре дружелюбный персонал предложит Вам присесть;
  • Предоставят одноразовую трубочку с тест-системой;
  • Необходимо подышать в трубочку 6 минут, не касаясь трубочкой слизистой и языка, чтобы избежать попадания слюны в неё;
  • Вам предложат выпить специальный раствор (карбамид). Он не имеет запаха и вкуса;
  • После этого ещё 6 минут необходимо подышать в трубочку;
  • По окончанию теста Вам выдадут документ с результатом теста, а наши врачи дадут рекомендации и при необходимости назначат грамотное лечение.

А теперь разберём, как проходит 13-С уреазный тест:

  • От Вас требуется соблюдение вышеуказанных правил подготовки;
  • Вам предоставят пакет, в который необходимо будет подышать. Затем его герметично закроют;
  • Вам дадут выпить стакан яблочного сока;
  • Через 30минут Вам нужно будет подышать в другой пакет, который тоже герметично закроют;
  • Оба пакета направят в лабораторию. После лабораторного исследования вам сообщат результат.

Сделали аэротест на хеликобактер, но не понимаете, что означает его результат?

У нас работают гастроэнтерологи с многолетним опытом, они регулярно повышают квалификацию.

После осмотра и сбора анамнеза они, при необходимости, сделают тест на хеликобактер пилори при фгдс или назначат сделать дыхательный тест на хеликобактер, могут быть назначены другие исследования. Вы получите расшифровку теста и грамотные рекомендации.

Не занимайтесь самолечением, обратитесь к специалисту!

Дыхательный тест с мочевиной 13C в диагностике инфекции Helicobacter pylori

Дыхательный тест на мочевину (UBT) — один из наиболее важных неинвазивных методов выявления инфекции Helicobacter pylori. В тесте используется гидролиз перорально вводимой мочевины ферментом уреазой, который H.pylori производит в больших количествах. Мочевина гидролизуется до аммиака и углекислого газа, который диффундирует в кровь и выводится из легких.CO2, меченный изотопами, может быть обнаружен в выдыхаемом воздухе с помощью различных методов. Маркировка мочевины 13C становится все более популярной, поскольку этот нерадиоактивный изотоп безвреден и может безопасно применяться у детей и женщин детородного возраста. Образцы дыхания также можно отправить по почте или курьером в удаленные аналитические центры. Тест прост в выполнении, и его можно повторять столько раз, сколько потребуется для одного и того же пациента. Необходимо дать еду, чтобы увеличить время контакта между индикатором и уреазой H.pylori в желудке.Тест был упрощен до такой степени, что двух проб, взятых из дыхания до и через 30 минут после приема мочевины в жидкой форме, достаточно для получения надежной диагностической информации. Стоимость производства 13C-мочевины высока, но возможно дальнейшее снижение дозировки путем введения ее в форме капсул. Масс-спектрометр изотопного состава (IRMS) обычно используется для измерения обогащения 13C в образцах выдыхаемого воздуха, но этот прибор дорогостоящий. Чтобы снизить эту стоимость, недавно было разработано новое и более дешевое оборудование, основанное на недисперсионной, изотопно-селективной, инфракрасной спектроскопии (NDIRS) и лазерном анализе соотношения (LARA).Это действительные альтернативы IRMS, хотя они не могут обрабатывать такое же большое количество проб дыхания одновременно. Эти многообещающие достижения, безусловно, будут способствовать более широкому использованию 13C-UBT, который особенно полезен для эпидемиологических исследований у детей и взрослых, для скрининга пациентов перед эндоскопией и для оценки эффективности схем эрадикации.

В Китае рекомендуется диапазон повторного тестирования для дыхательных тестов с мочевиной 13C и 14C на инфекцию Helicobacter pylori | Патогены кишечника

Обзор всего исследования

Схема экспериментальной программы показана на рис. 1.

Рис. 1

Обзор всего исследования

Развитие исследования

Во время клинической практики мы заметили, что некоторые результаты UBT противоречили результатам, определенным с помощью гистопатологического исследования, что побудило нас пересмотреть диагностическую эффективность коммерческих наборов 13 C-UBT и 14 C-UBT, используемых для скрининга инфекции H. pylori в нашей больнице.

Определение критериев исследования

Следующие критерии исключения были применены к нашим испытуемым: (i) предыдущее лечение H.pylori , (ii) получали ингибитор протонной помпы, антагонист рецептора H 2 , отхаркивающее средство или лечение антибиотиками в течение последних четырех недель до эндоскопии, (iii) хирургическое вмешательство в анамнезе, (iv) диагностировали рак желудочно-кишечного тракта, ( v) имел тяжелое заболевание сердца, легких, печени, почек или системы крови, (vi) в возрасте до 18 или старше 70 лет и (vii) беременность.

Одобрение этики

Это исследование было одобрено комитетом по этике исследований Народной больницы Шэньчжэня Куйчун (Номер ссылки.201609) и зарегистрирован на сайте www.chictr.org.cn (Регистрационный номер ChiCTR2000041570). Каждого пациента гастроэнтеролог подробно ознакомил с целью и процессом исследования. Письменное и информированное согласие было получено от всех пациентов до их участия в исследовании.

Исследуемая популяция

С января 2017 г. по ноябрь 2018 г., после применения критериев исключения, 484 пациента (18–70 лет) посетили Народную больницу Шэньчжэня Куйчун (26 Kuixin N Road, Dapeng New District, Город Шэньчжэнь, Китай) для эндоскопического обследования согласились участвовать в этом исследовании.

Перед сеансом эндоскопии пациенты получили либо 13 C-UBT, либо 14 C-UBT по усмотрению гастроэнтеролога с использованием метода чередования. Общая информация о состоянии здоровья пациентов была собрана клиническими медсестрами. Во время эндоскопии были собраны два образца биопсии желудка (по одному из антрального отдела и тела) для гистопатологического исследования. Гистологическое исследование было выполнено Клинической лабораторией Даань, сторонним поставщиком услуг патологии.{2} \ left ({1 — Prev} \ right)}} \) где Z, значение нормального распределения, было установлено на 1,96, что соответствует 95% доверительному интервалу, а d , максимально допустимая ширина 95% доверительный интервал был установлен равным 10%. На основании предыдущего исследования было показано, что UBT достигает значения чувствительности 96% и значения специфичности 93% [10]. Уровень распространенности (Prev) H. pylori в Шэньчжэне, Китай, составил 35,85% [11]. Исходя из вышеперечисленных критериев, для этого исследования требовалось не менее 41 H.pylori -положительные пациенты (n1) и 39 H. pylori -отрицательные пациенты (n2), что дает минимальный общий размер выборки 80 участников для каждого теста UBT.

Дыхательный тест на мочевину

13 К-УБТ

Анализ 13 C-UBT (Beijing Boran Pharmaceutical Co. Ltd., Китай) был выполнен в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, у каждого пациента после голодания в течение не менее четырех часов перед приемом капсулы, содержащей 50 мг меченой изотопом 13 C мочевины, был взят образец исходного дыхания с 80–100 мл воды.После 30 мин сидения выдыхаемый воздух снова собирался. Содержание 13 CO, 2 в начальной и 30-минутной воздушной подушках выдоха анализировали с использованием инфракрасного спектрометра HG-IRIS13C (Beijing Richen-Force Science & Technology Co., Китай). Через 30 минут введения значение дельта относительно исходного уровня (DOB) 4% или выше рассматривалось как положительный индикатор инфекции H. pylori .

14 C-UBT

Модель 14 C-UBT (Zhonghe Headway Bio-Sci & Tech Co. Ltd., Китай) выполнялась согласно инструкции производителя. Вкратце, пациентов, голодавших не менее четырех часов, просили проглотить желатиновую капсулу, содержащую 0,75 мкКи изотопа 14 C, с 20 мл воды. Через 25 минут каждого пациента просили непрерывно выдыхать в бутылку до тех пор, пока пурпурная удерживающая жидкость CO 2 внутри не станет бесцветной. Затем добавляли сцинтилляционную жидкость, и в гомогенизированном растворе измеряли количество 14 CO 2 .Показатель с более чем 100 распадами в минуту (DPM) был классифицирован как H. pylori положительный.

Гистопатология

Два образца биопсии желудка (по одному из антрального отдела и тела) были отправлены в клиническую лабораторию Даань (Гуанчжоу, Китай) для гистопатологического исследования. Гистопатологи не знали результатов UBT. Присутствие Helicobacter--подобных микроорганизмов подтверждалось стандартным окрашиванием гематоксилином и эозином (HE). Окрашивание по Гимзе выполняли дополнительно, если HE не мог подтвердить присутствие H. pylori , и у тех пациентов, у которых был хронический активный гастрит, но не было обнаружено H. pylori в пятнах HE.

Статистический анализ

Значения чувствительности и специфичности каждого метода UBT были представлены в соответствии с рекомендованным производителем пороговым значением. Чтобы оценить диагностические возможности каждого метода UBT, была построена кривая рабочей характеристики приемника (ROC) путем нанесения истинно-положительного показателя на оси y против истинно-отрицательного показателя на оси x [12].Наш ROC-анализ был выполнен с использованием пакета R pROC (версия 1.16.2) [13]. Площадь под кривой (AUC) была рассчитана для количественной оценки общей точности каждого метода UBT для диагностики исходов инфекции H. pylori . Оптимальное значение отсечки UBT, которое дает наивысшую частоту истинных положительных результатов вместе с самой низкой частотой ложных срабатываний, было определено с использованием метода максимального индекса Юдена, где индекс Юдена = чувствительность + специфичность — 1 [14]. Для сравнения категориальных переменных использовался точный критерий Фишера.Уровень статистической значимости считали p <0,05.

Интерпретация дыхательного теста с 13C-мочевиной среди большой группы детей младшего возраста из развивающейся страны

13 Дыхательные тесты с C-мочевиной были выполнены в течение 2-летнего периода с интервалом не менее 3 месяцев в 1532 случаях у 247 младенцев и детей в возрасте от 3 до 48 месяцев из сообщества сельских фермеров, ведущих натуральное хозяйство в Гамбии, в рамках эпидемиологического исследования распространенности H.pylori в молодом возрасте и его влияние на рост (4,12) . Полная информация о выборе предмета и других аспектах исследования описана в другом месте (4,12) . Протоколы исследования были одобрены Объединенным комитетом по этике MRC и правительства Гамбии, а также собранием деревенских старейшин. Дети были включены в исследование только после получения информированного согласия родителей от полевых работников, свободно владеющих местным языком.

Базовый образец дыхания был получен у детей вскоре после пробуждения с использованием лицевой маски и резервуара для выдыхаемого воздуха (13) .Сразу после этого напиток, содержащий 50 мг 13 C-мочевины (избыток 99 ат.%, Cambridge Isotopes, Кембридж, Массачусетс), 50 мг естественной мочевины, 0,5 мг / кг эликсира лактулозы (BP) и пробный завтрак 5 г полимера глюкозы (Polyosis, Abbott Laboratories, Queensborough, Kent, UK), растворенного в соответствующем количестве воды. Дальнейшие пробы дыхания были собраны через 5, 15, 30 и 60 минут.

Образцы выдыхаемого воздуха хранили в вакуум-контейнерах объемом 20 мл (Becton Dickinson, Cowley, Oxford, UK) и транспортировали в Кембридж, Великобритания.Двуокись углерода криогенно отделяли от образцов с использованием автоматизированной системы и анализировали с помощью масс-спектроскопии изотопного состава газа (SIRA 10, VG Isotech, UK). Изотопное обогащение было выражено как скорректированная Крейгом дельта (14) (‰) относительно международного стандарта PDB с использованием формулы (Уравнение 1), где R — изотопное соотношение ( 13 C: 12 C) образца или стандарта. Обогащение 13 C с поправкой на исходный уровень определяли как разницу в изотопном обогащении между исходным дыхательным образцом и образцом во времени после этого.Концентрация водорода в выдыхаемом воздухе измерялась электрохимическим методом.

Первоначальная оценка данных дыхательного теста 13 C-мочевины была проведена до и после преобразования журнала с использованием оценок ядра функции плотности (15) для получения сглаженных гистограмм, которые использовались для получения визуального впечатления о существовании отдельные популяции в наборе данных. После оценки количества таких субпопуляций, средние значения и дисперсии отдельных субпопуляций в когорте в каждом возрасте и в общем наборе данных были оценены с помощью процедуры Genstat с использованием алгоритма максимизации ожидания (16) .Эти значения затем использовались для определения оптимального порогового значения, которое различает подгруппы населения, и для расчета доли результатов, которые были бы правильно присвоены каждой подгруппе, с использованием этого рассчитанного порогового значения во всем наборе данных. .

Чтобы проиллюстрировать уместность порогового значения, была изучена другая группа гамбийских детей. Эндоскопия верхних отделов желудочно-кишечного тракта была выполнена 14 детям в возрасте от 6 до 28 месяцев (в среднем 16 месяцев) со стойкой диареей и недоеданием, чтобы получить диагностическую биопсию тонкой кишки.Ни один из детей не получал лечения противомикробными препаратами во время или непосредственно перед процедурой. Были также получены четыре биопсии желудка: две из отдельных участков антрального отдела, одна из тела и одна из режущего края. Их фиксировали в забуференном формалине и перевезли в Оксфорд, Великобритания, где они были исследованы на наличие H. pylori . Срезы каждой биопсии окрашивали гематоксилином и эозином, толуидиновым синим, альциановым синим и периодической кислотой-Шиффа. H. pylori были идентифицированы по морфологии, и специфическое окрашивание антител (набор DAKO, Glostrup, Дания) использовалось для проверки наличия или отсутствия H. pylori в 10 случаях. 13 Дыхательные пробы C-мочевины были выполнены с использованием метода, описанного выше, каждому из этих 14 детей в день эндоскопии.

Корреляция между количественным тестом на дыхание с 13C-мочевиной и успехом лечения Helicobacter pylori в популяционной когорте

Предпосылки .Постоянно предпринимаются попытки определить факторы, влияющие на успех терапии первой линии для инфекции Helicobacter pylori ( H. pylori ). Результат дыхательного теста с мочевиной 13 (C13-UBT) использует уреазную активность H. pylori и представляет собой высокоточный диагностический анализ. Мы стремились определить, связана ли величина результата C13-UBT с успехом лечения. Методы . В исследование были включены взрослые пациенты, которые впервые прошли дыхательный тест на содержание С-мочевины 13 в период с января 2010 года по январь 2016 года.Чтобы изолировать наивную популяцию, проходившую тестирование и лечение, которая вряд ли прошла первоначальный эндоскопический тест H. pylori , мы исключили пациентов старше 45 лет и пациентов с предыдущим C13-UBT. Данные взяты из базы данных лаборатории Службы здравоохранения Клалит. Результатов . В исследование были включены 94 590 пациентов (36,1% мужчин, возраст 28,5 ± 6,0 лет), впервые перенесших C13-UBT в течение периода исследования. C13-UBT был положительным у 48 509 (51,3%) пациентов. Подтверждающая постобработка C13-UBT была проведена 18 375 (37.8%), а ликвидация была успешной у 12 018 (65,4%). Среднее значение C13-UBT составило 20,6 ± 16,2 DOB у субъектов с успешной эрадикацией и 19,5 ± 13,1 DOB у субъектов с неэффективным лечением (OR 1,01; 95% CI 1,00–1,01). Среди пациентов в верхнем квинтиле измерения C13-UBT эрадикация была достигнута у 67,6% по сравнению с 62,6% в нижнем квинтиле (OR 1,22; 95% CI 1,11–1,35). Субъекты в верхнем 1 процентиле (C13-UBT ≥ 70 DOB) достигли эрадикации в 75,0% по сравнению с 65,3% среди субъектов с C13-UBT <70 DOB (OR, 1.59; 95% ДИ 1,05–2,41,). Выводы . Превосходство в эрадикации H. pylori , наблюдаемое у субъектов с более высоким DOB C13-UBT, невелико, но значимо. Дальнейшие исследования должны изучить физиологические и микробиологические основы этого открытия.

1. Введение

Helicobacter pylori ( H. pylori ) Инфекция поражает до 50% населения мира и является основной причиной язвенной болезни, рака желудка и лимфомы MALT [1].Наиболее доступным и точным неинвазивным тестом для диагностики H. pylori является дыхательный тест с С-мочевиной 13 (C13-UBT) [2]. В этом тесте используется способность организма продуцировать уреазу и измеряется 13 CO 2 с истекшим сроком годности после перорального приема 13 C-мочевины. Когда присутствует инфекция H. pylori , 13 C-мочевина расщепляется бактериальной уреазой до 2NH 3 и 13 CO 2 .Абсорбируется 13 CO 2 выводится через легкие и измеряется в выдыхаемом воздухе на исходном уровне и через 30 минут после приема индикатора. На положительный результат указывает повышение уровня 13 C с истекшим сроком действия по сравнению с исходным уровнем или дельта по сравнению с исходным уровнем (DOB) [3–5].

На величину DOB влияет множество факторов, связанных с пациентом, включая пол, национальность, голодание, лекарства и осанку [6–9]. Характеристики теста, такие как 13 дозировка C-мочевины, пробный прием пищи и продолжительность теста, также напрямую связаны с точностью C13-UBT и могут влиять на величину DOB [10–15].

Величина DOB также связана с серьезностью инфекции H. pylori . Было показано, что плотность H. pylori , а также гистопатологическая хроничность и индексы активности положительно коррелируют с величиной DOB [16–25]. С другой стороны, не наблюдается явной корреляции между величиной DOB и диспепсией или язвенной болезнью [21, 25, 26].

Ликвидация H. pylori остается сложной задачей, и предпринимаются постоянные усилия по выявлению факторов, влияющих на успех лечения.Связь между гистопатологической серьезностью гастрита и вероятностью успеха лечения сложна. Несколько исследований показали, что более высокая степень хронического активного воспаления в слизистой оболочке желудка связана с успехом лечения H. pylori [27–30]. С другой стороны, высокая степень атрофии слизистой оболочки снижает вероятность успеха лечения [30]. Неясно, связана ли величина результата C13-UBT с успехом лечения. Целью этого исследования было выяснить, связан ли результат C13-UBT с вероятностью последующей успешной эрадикации H.pylori .

2. Материалы и методы
2.1. Пациенты

Мы ретроспективно идентифицировали взрослых пациентов старше 18 лет, которые впервые прошли 13 дыхательный тест на C-мочевину (C13-UBT) в период с 1 января 2010 г. по 31 декабря 2015 г. в Службе здравоохранения Клалит (CHS). Чтобы исключить пациентов, которые, возможно, ранее получали лечение антибиотиками от H. pylori , мы сначала исключили пациентов ≥ 45 лет, которые могли пройти первичную эндоскопию на основе H.pylori в соответствии с рекомендациями на момент включения [31]. Впоследствии мы исключили субъектов, которые прошли курс C13-UBT за 2 года до включения (1 января 2008 г. — 31 декабря 2009 г.). Наконец, мы исключили пациентов, которые прошли C13-UBT после отрицательного результата теста. Для целей этого исследования мы предположили, что лечение антибиотиками проводилось после положительного результата C13-UBT и до последующего C13-UBT.

2.2. Сбор и анализ образцов

Образцы дыхания были получены в учреждениях CHS, которые включают 14 больниц и 1300 поликлиник первичного звена и специализированных клиник в восьми округах.Дыхательные тесты проводились специализированными медсестрами. Пациентам давали 75 мг 13 C-меченой мочевины, смешанной с пробной едой из 100 мл апельсинового сока. Все образцы дыхания C13-UBT были транспортированы и обработаны в центральной лаборатории Медицинского центра Рабина, Петах-Тиква, Израиль. Образцы анализировали с помощью автоматического пробоотборника дыхания Gilson XL222 (Gilson, Middleton, WI, США) и масс-спектрометра изотопного отношения AP2003 (IRMS) (Analytical Precision, Phoenix, AZ, США). Соотношение 13 C и 12 C с истекшим сроком годности, измеренное в частях на тысячу, было получено на исходном уровне и через 30 минут после приема внутрь 13 C-мочевины (T30-T0).Конечный результат был выражен как разница между двумя оценками, дельта относительно исходного уровня (DOB). Пороговое значение 3,5 DOB использовалось в соответствии со спецификациями производителя. Повышение DOB выше 3,5 считалось положительным при наличии инфекции H. pylori .

2.3. Извлечение данных

Демографические данные и результаты C13-UBT были извлечены из центральной компьютеризированной базы данных CHS. CHS — крупнейшая организация по поддержанию здоровья в Израиле и вторая по величине организация по поддержанию здоровья в мире, насчитывающая более трех организаций.8 миллионов абитуриентов. Данные были получены и сохранены после одобрения Институционального наблюдательного совета Медицинского центра Рабина и в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и надлежащей клинической практики.

2.4. Статистический анализ

Все анализы были выполнены с использованием программного обеспечения для статистического анализа SPSS версии 24.0 (IBM Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Распределения непрерывных переменных оценивались на нормальность с помощью критерия Колмогорова-Смирнова (отсечение при) и описываются как средние значения ± стандартное отклонение (SD).Номинальные переменные сравнивались с помощью критерия хи-квадрат. Кривая оператора приемника (ROC) была построена и проанализирована с помощью индекса Юдена. В статистическом анализе использовалась многомерная модель прямой логистической регрессии для оценки отношения шансов (OR) и 95% доверительного интервала. Все тесты были двусторонними и считались значимыми при.

3. Результаты

Всего было включено 94 590 субъектов (36,1% мужчин, возраст 28,5 ± 6,0 лет), которые впервые прошли C13-UBT в течение периода исследования.C13-UBT был положительным у 48 509 (51,3%) пациентов. Подтверждающая постобработка C13-UBT была проведена у 18 375 (37,8%), а эрадикация была успешной у 12 018 (65,4%).

Среди 18 375 H. pylori -положительных субъектов, перенесших второй C13-UBT, средняя начальная запись C13-UBT составляла 20,6 ± 16,2 DOB среди субъектов с успешной эрадикацией и 19,5 ± 13,1 DOB у субъектов с неэффективным лечением (OR , 1.01; 95% ДИ 1.00-1.01,) (Таблица 1). ROC-анализ показал, что отсечка 14.9 DOB может предсказать успех лечения с чувствительностью 45,2% и специфичностью 58,5%.


Успешное лечение Неудачное лечение

(%)
C13-UBT DOB, среднее (СО) 20,6 (16,2) 19,5 (13,1) <0,01
Пол, мужской, (%) 4264 (35.5) 2121 (33,4) <0,01
Возраст, лет, среднее (стандартное отклонение) 28,9 (5,9) 28,4 (5,9) <0,01

Сокращения: C13-UBT: 13 Дыхательный тест на C-мочевину; Дата рождения: дельта относительно базовой линии.

Среди пациентов в верхнем квинтиле измерения C13-UBT эрадикация была достигнута у 67,6% по сравнению с 62.6% в нижнем квинтиле (ОШ 1,22; 95% ДИ 1,11–1,35) (рис. 1). Результаты были аналогичными при использовании модели многомерной логистической регрессии с поправкой на возраст и пол (OR 1,28; 95% CI 1,15–1,42;) (таблица 2).


–1.02 –1.02

OR 95% CI

C13-UBT
Верхний квинтиль DOB 1.28 1,15–1,42 <0,01
Мужской пол 1,13 1,06–1,21 <0,01
Возраст

Сокращения: C13-UBT: 13 Дыхательный тест на C-мочевину; Дата рождения: дельта относительно базовой линии.

Субъекты из первого процентиля с C13-UBT ≥ 70 DOB достигли эрадикации в 75.0% по сравнению с 65,3% среди субъектов с C13-UBT <70 DOB (OR 1,59; 95% CI 1,05–2,41) (рис. 2). Результаты были аналогичными при использовании модели многомерной логистической регрессии с поправкой на возраст и пол (OR 1,62; 95% CI 1,07–2,45) (таблица 2).


4. Обсуждение

Мы обнаружили, что среди субъектов, перенесших C13-UBT, по мере увеличения DOB вероятность успешного искоренения H. pylori также увеличивается.

Величина значения DOB напрямую связана с H.pylori активность уреазы. Поэтому неудивительно, что величина DOB коррелировала с плотностью H. pylori , измеренной с помощью ПЦР, а также со степенью хронического активного воспаления, о чем свидетельствует инфильтрация лимфоцитов и нейтрофилов в слизистой оболочке желудка [16 –25, 32]. Величина ДОБ также коррелировала с частотой и интенсивностью диспепсии [33]. С другой стороны, атрофия слизистой оболочки желудка связана со снижением бактериальной плотности [34, 35].Отсюда следует, что пациенты с большей степенью атрофии слизистой оболочки желудка имеют более низкую величину DOB [23, 32]. Низкое соотношение PGI / II, указывающее на атрофию желудка, также коррелировало с более низкой величиной DOB [32]. Однако следует отметить, что другие исследования не обнаружили связи между плотностью бактерий и величиной DOB, хотя эти исследования не включали оценку хронического активного воспаления [36, 37].

В предыдущем исследовании изучалась взаимосвязь между величиной DOB и успехом лечения.В отличие от наших результатов, Gisbert et al. не обнаружили корреляции между величиной DOB и вероятностью успешного искоренения среди 600 субъектов [38]. Предыдущие исследования изучали связь между оценкой воспаления, измеренной по пересмотренной Сиднейской системе, и вероятностью успешного лечения [39]. Три исследования показали, что более высокая степень хронического активного воспаления связана с успехом лечения [27–29]. Дополнительное исследование показало, что высокая степень атрофии слизистой оболочки снижает вероятность успеха лечения [30].Эти исследования не включали молекулярную оценку бактериальной нагрузки или количественный анализ C13-UBT. Однако, если мы рассмотрим доказательства того, что величина DOB прямо пропорциональна инфильтрату воспалительных клеток и обратно пропорциональна атрофии, как обсуждалось, то эти исследования могут согласовываться с нашими выводами, которые предполагают, что величина DOB пропорциональна успеху лечения. Взятые вместе, кажется, что субъекты с более тяжелым воспалительным инфильтратом с большей вероятностью будут иметь высокую бактериальную нагрузку, более высокий DOB и больший успех лечения.Субъекты с атрофией слизистой оболочки и более низкой бактериальной нагрузкой с большей вероятностью будут иметь более низкую величину DOB и большую неэффективность лечения. Ясно, что эти два сценария во многом пересекаются, и, хотя это может быть достоверное наблюдение в условиях популяции, оно мало актуально для отдельного пациента.

Существует несколько возможных механизмов, почему высокий показатель DOB или оценка воспаления связаны с успехом лечения. Усиление хронического активного воспаления может вызвать благоприятный ответ хозяина, который облегчит уничтожение организма при соответствующем лечении.Labenz et al. обнаружили, что пациенты с успешной эрадикацией имели более высокий pH желудочного сока по сравнению с пациентами с неэффективным лечением. Более высокий pH может усилить действие амоксициллина за счет снижения минимальной ингибирующей концентрации, повышения стабильности препарата в просвете желудка и увеличения концентрации в просвете за счет замедления опорожнения желудка [40–42]. Тем не менее, взаимосвязь между величиной DOB и оценкой воспаления не совсем ясна, и эти механизмы могут только объяснить, почему воспаление, но не DOB, связано с успехом лечения.

Ограничением нашего исследования является отсутствие данных гистопатологии для корреляции наших результатов. Еще одно ограничение — это вероятное присутствие нескольких факторов, влияющих на ситуацию, которые невозможно учесть. Во-первых, существует множество факторов, которые определяют величину DOB, помимо плотности бактерий, которые могут объяснить наблюдаемую разницу в успехе лечения. К ним относятся факторы пациента, бактериальные факторы и тестовые / лабораторные факторы [6–15]. Во-вторых, существуют смешанные факторы, которые могут объяснить различия в успехе лечения.К ним относятся приверженность к лекарствам, устойчивость к антибиотикам, режим антибиотиков, лекарственные взаимодействия, полиморфизм CYP2C19 и курение. Тем не менее, учитывая большой размер выборки, маловероятно, что учет этих факторов существенно повлияет на результаты. Еще одним ограничением является относительно низкий уровень эрадикации — 65,4%. Предыдущие данные показывают, что более 90% пациентов получали тройную терапию на основе кларитромицина [43], несмотря на то, что первичная резистентность H. pylori к кларитромицину в нашем регионе составляет> 20% [44, 45].В соответствии с действующими рекомендациями по лечению тройная терапия на основе кларитромицина не рекомендуется в регионах, где первичная резистентность к кларитромицину превышает 15% [1, 46]. Тем не менее тройная терапия на основе кларитромицина остается наиболее распространенным протоколом лечения [43]. Если бы субъекты получали более эффективные схемы лечения с более высокой степенью эрадикации, возможно, что величина DOB больше не была бы в значительной степени связана с успехом лечения.

Для целей данного исследования мы предположили, что лечение антибиотиками проводилось после положительного результата C13-UBT и до последующего C13-UBT.Некоторые субъекты, однако, могли не получать лечения или могли пройти более одного курса лечения до повторения C13-UBT. У нас нет данных о различных протоколах лечения. Хотя мы исключили субъектов старше 45 лет, некоторые субъекты могли пройти тесты на основе эндоскопии для диагноза H. pylori и, возможно, прошли лечение до индексного теста. Наконец, наша когорта ограничена 18–45-летними. Мы исключили пациентов старше 45 лет, поскольку эти пациенты с большей вероятностью прошли эндоскопию верхних отделов желудочно-кишечного тракта в качестве первоначального теста на диспепсию.В противном случае пациенты с положительным результатом C13-UBT после положительного результата эндоскопического теста и последующего лечения были бы ошибочно классифицированы как не леченные. Поскольку мы не смогли надежно идентифицировать пациентов, которые ранее прошли тест на основе эндоскопии на H. pylori , мы решили исключить пациентов старше 45 лет. Наши результаты могут быть неприменимы к пожилым пациентам с более длительной инфекцией, более высокими показателями атрофии желудка и, возможно, лучшим соблюдением режима лечения.Сила нашего исследования заключается в большой когорте, строгих критериях исключения и качестве используемой базы данных.

В заключение мы обнаружили, что более высокая величина DOB связана с большей степенью успешной эрадикации H. pylori . Дальнейшие исследования, которые включают гистопатологические и клинические переменные, необходимы для проверки и выяснения физиологической основы наших результатов.

Доступность данных

Необработанные данные, использованные для подтверждения выводов этого исследования, можно получить у соответствующего автора по запросу.

Конфликт интересов

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Сравнение точности дыхательных тестов с мочевиной 13C и 14C: нужна ли еще категория с неопределенными результатами?

Abstract

Инфекция Helicobacter pylori является ведущей причиной язвенной болезни. Целью этого исследования было, во-первых, оценить разницу в распределении отрицательных и положительных результатов между более старым дыхательным тестом на С-мочевину 14 и новым дыхательным тестом на С-мочевину 13 и, во-вторых, определить, можно ли использование категории неопределенных результатов по-прежнему имеет смысл, и какой тип результатов должен вызывать повторное тестирование. Методы: Был проведен ретроспективный опрос всех последовательных пациентов, направленных в нашу службу для проверки дыхания на мочевину. Мы проанализировали 562 пациента, прошедших тестирование с использованием 14 C-мочевины, и 454 пациента, прошедших тестирование с использованием 13 C-мочевины. Результаты: По сравнению с широким распределением отрицательных результатов 14 C, отрицательные результаты 13 C были распределены дальше от порогового значения и были более плотно сгруппированы вокруг среднего отрицательного значения.Анализ распределения отрицательных результатов тестирования 13 C по сравнению с результатами тестирования 14 C выявил статистически значимую разницу между ними. В группе 13 C только 1 пациент мог быть классифицирован как имеющий неопределенные результаты с использованием той же неопределенной зоны, которая использовалась для группы 14 C. Это значительно реже, чем то, что было обнаружено для группы 14 C. Обсуждение: Гранично-отрицательные результаты действительно возникают при дыхательном тесте на С-мочевину 13 , хотя и реже, чем при дыхательном тесте на С-мочевину 14 , и мы будем внимательно отслеживать различия между 3.0 и 3,5% Δ. 13 Дыхательный анализ на содержание C-мочевины безопасен и прост для пациента и в большинстве случаев дает более четкие положительные или отрицательные результаты для клинициста.

Инфекция, вызванная Helicobacter pylori , является основной причиной язвенной болезни. В развитых странах распространенность колеблется от 25% до 50%. Это также связано с раком желудка и лимфомой лимфоидной ткани слизистой оболочки (1). Дыхательный анализ мочевины основан на производстве H. pylori уреазы, фермента, который превращает мочевину в аммоний и CO 2 .Доза мочевины, меченная изотопом углерода, 13 C или 14 C, пациент принимает перорально. У инфицированного пациента активность уреазы в слизистой оболочке желудка из-за присутствия H. pylori разрушает меченую мочевину, и преобразованный меченый CO 2 диффундирует к эпителиальным клеткам, переносится в кровоток, и в конечном итоге выдыхается легкими. Образец выдыхаемого воздуха пациента может быть измерен для определения количества выдыхаемого CO 2 и, следовательно, наличия или отсутствия H.pylori (2).

13 C — нерадиоактивный изотоп углерода, который измеряется масс-спектрометрией изотопного отношения. 14 C — радиоактивный изотоп углерода, который измеряется сцинтилляционным счетчиком. Доза облучения, полученная при стандартной поглощенной активности, оценивается в менее 0,003 мЗв (2), что тривиально по сравнению с годовой дозой, полученной от фонового излучения в Канаде (1,8 мЗв / год) и от обычных радиологических исследований (в среднем 5 –30 мЗв на исследование).Тем не менее, недоверие к радиации не является проблемой с 13 C и может облегчить жизнь некоторым пациентам и врачам.

Из-за нехватки 14 C нам пришлось перейти с 14 C- на 13 C-мочевинный анализ дыхания, и мы решили использовать коммерческий набор (Helikit; Paladin Labs Inc.). Точность этой альтернативы здесь не подвергается сомнению, поскольку надлежащий анализ с использованием данных биопсии в качестве золотого стандарта был проведен до коммерциализации (3). Однако в нашей популяции мы обнаружили некоторые различия в распределении положительных и отрицательных результатов между новым тестированием 13 C и более старым тестом 14 C.Мы имели обыкновение отзывать пациентов и повторять тестирование, когда их результаты были слишком близки к пороговому значению. Коммерческий набор не определяет категорию неопределенных результатов, а только обеспечивает отсечку для положительных результатов.

Таким образом, в этом исследовании мы стремились оценить разницу в распределении отрицательных и положительных результатов между старым тестом 14 C и новым тестом 13 C. Кроме того, мы стремились определить, может ли использование категории неопределенных результатов иметь смысл и какие результаты должны вызывать повторное тестирование у данного пациента.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Был проведен ретроспективный опрос всех последовательных пациентов, направленных в нашу службу для 14 дыхательного теста C-мочевины в период с 2005 по 2009 год или для 13 дыхательного теста C-мочевины в период с 2011 по 2013 год. Исследование был проведен в больнице при университете после того, как местная комиссия по этике одобрила его и отказалась от требования получать информированное согласие. Мы исключили 8 пациентов с неадекватными результатами выборки. Результаты уже были интерпретированы и использовались при ведении направленных пациентов.Собранные данные хранились в защищенной паролем электронной таблице на зашифрованном диске. Личная информация пациентов была удалена в конце сбора данных.

Подготовка пациента

Подготовка пациента была относительно простой (Приложение A), хотя для минимизации риска ложноотрицательных результатов был необходим тщательный анализ лекарств, принимаемых каждым пациентом (2). Пациентам было рекомендовано прекратить прием антибиотиков и висмутсодержащих продуктов за 1 мес. Перед тестом, ингибиторов протонной помпы и сукральфата в течение 2 недель, а также блокаторов H 2 и антацидов, отпускаемых без рецепта, в течение 24 часов.Их также попросили голодать не менее 6 часов и воздерживаться от курения не менее 2 часов.

Протокол испытаний

Helikit поставляется с пластиковым стаканом, содержащим 75 мг 13 C-мочевины, лимонной кислоты, усилителей вкуса и стабилизаторов; 2 пробирки Exetainer (Labco Limited) с цветными этикетками и завинчивающимися крышками; соломка; и держатель для транспортировки пробирок. Используя соломинку, голодные пациенты полностью выдыхают в трубку с исходным уровнем, которая затем закрывается крышкой и маркируется. Напиток готовится путем добавления 75 мл водопроводной воды к порошку в чашке, которую осторожно встряхивают для растворения содержимого.Затем пациент принимает напиток и через 30 минут сдает еще один образец дыхания. Эта вторая трубка закрыта крышкой и снабжена этикеткой.

Анализы выполняли на масс-спектрометре Finnigan MAT 252 для определения соотношения изотопов (Thermo Electron Corp.). Необработанные данные были получены в единицах разницы на тысячу, что относится к содержанию 13 C по отношению к международному стандарту Pee Dee Belemnite, показателю отношения стабильного изотопа 13 C к стабильному изотопу 12 C , указывается в долях на тысячу (% Δ).Отличие от базового уровня относится к разнице на тысячу между базовым уровнем и выборкой публикации.

Анализ и отсечение

Для стандартизации и сравнения распределения результатов между двумя тестами значение каждого образца было разделено на его собственное пороговое значение (S / CO), что дало отрицательные результаты ниже 1,0 и положительные результаты выше 1,0 для каждого из них. 13 C и 14 C. Испытательная группа.

Распределение было проанализировано с использованием формул и инструментов анализа Microsoft Excel.Среднее значение и стандартное отклонение, а также тест Стьюдента t и Вилкоксона использовались для оценки разницы в распределении между положительными и отрицательными группами и между кластерными группами 13 C и 14 C.

РЕЗУЛЬТАТЫ

562 пациента прошли тестирование 14 C. Из них результаты для 366 (65,1%) были ниже порогового значения 0,33 отсчета в секунду (имп / с) и, таким образом, были сочтены отрицательными, а результаты для 196 (34,9%) были положительными.

Положительное пороговое значение для тестирования 13 C было определено как разница более 3,5% Δ. Из 454 пациентов, прошедших тестирование 13 C, у 335 (73,8%) были отрицательные результаты, а у 119 (26,2%) — положительные.

Анализ отрицательных результатов

Из 366 пациентов с отрицательными результатами 14 C среднее значение составило 0,0118 ± 0,0050 имп / с. Деление на порог 0,33 сП дает в среднем 0,357 ± 0,150 S / CO. Из 335 пациентов с отрицательными результатами 13 C средняя разница составила 0.360 ± 0,293% Δ. Разделение на 3,5% Δ-порог дает в среднем 0,103 ± 0,084 S / CO.

Визуальная оценка распределения результатов (рис. 1) показала, что отрицательные результаты 13 C были распределены дальше от порогового значения ( y — ось 1,0 при стандартизации S / CO) и были более плотно сгруппированы вокруг среднего значения. отрицательное значение, в отличие от отрицательных результатов 14 C, которые были более широко распространены, хотя и ближе к пороговому значению.

РИСУНОК 1.

Распределение отрицательных результатов (S / CO <1.0) для дыхательных тестов с мочевиной 13 C и 14 C.

Непарные t тестирование распределения отрицательных результатов 13 C по сравнению с отрицательными результатами 14 C выявило статистически значимое различие со значением P 1,68 × 10 −70 . Аналогичным образом, анализ Манна-Уитни-Уилкоксона для непараметрической статистики дал значение P , равное 9,67 × 10 -65 , что снова было очень значимым.

Анализ отрицательных различий

Учитывая, что результаты тестирования 13 C были рассчитаны путем вычитания двух последовательных измерений, 49 пациентов имели отрицательное значение разницы. Хотя это явно ниже порогового значения в 3,5% Δ для положительности, возникает вопрос о достоверности измерений. Эти отрицательные различия составляли от -0,01 до -1,89% Δ. Наименьшее значение (-1,89% Δ) либо было выбросом, либо попало в удлиненный левый хвост распределения отрицательных значений, как показано на Рисунке 2.

РИСУНОК 2.

Распределение отрицательных результатов для дыхательного теста 13 С-мочевина.

В целом, распределение отрицательных результатов для тестирования 13 C, по-видимому, следовало несколько пиковой кривой около среднего значения 0,36 ± 0,47. Однако эта кривая была смещена вправо с расчетной асимметрией 2,67, что указывает на то, что большинство отрицательных результатов были сгруппированы слева от среднего отрицательного значения и что правый хвост был длиннее левого. Эксцесс был довольно повышенным, расчетное значение — 13.49, что свидетельствует о том, что по сравнению с колоколообразным распределением центральный пик был выше и острее, а его хвосты длиннее. Это могло объяснить отрицательные результаты, поскольку значения попадали в длинный левый хвост распределения отрицательных результатов.

Зона неопределенных результатов

Для тестирования 14 C результаты, которые упали между 0,30 и 0,33 сП, были классифицированы как неопределенные. Это соответствует интервалу 0,90–1,00 S / CO. Из 562 пациентов, прошедших тестирование 14 C, 8 (1.42%) были классифицированы как имеющие неопределенный результат.

Из 454 пациентов, прошедших тестирование 13 C, только 1 (0,22%) мог быть классифицирован как имеющий неопределенные результаты с использованием того же диапазона 0,90–1,00 S / CO. Это соответствует интервалу разности 3,0–3,5% Δ.

Разница в распределении между неопределенными и определенными (отрицательными и положительными) результатами для тестирования 13 C была статистически значимой, с двусторонним значением P , равным 0.0480 (точный тест Фишера).

Анализ положительных результатов

Из 196 пациентов с положительными результатами 14 C (рис. 3) среднее значение составило 0,300 ± 0,172 имп / с, с соответствующим 5,210 ± 0,172 S / CO. Из 119 пациентов с отрицательными результатами 13 C средняя разница составила 20,658 ± 10,359% Δ, и, таким образом, 5,920 ± 2,960 S / CO.

РИСУНОК 3.

Распределение положительных результатов (S / CO> 1,0) для дыхательных проб с мочевиной 13 C и 14 C.

Непарный t тестирование распределения положительных результатов 13 C по сравнению с положительными результатами 14 C выявило статистически значимое различие со значением P , равным 2,15 × 10 −7 . Анализ Вилкоксона для непараметрической статистики дал значение P , равное 9,05 × 10 -5 , что снова было статистически значимым.

ОБСУЖДЕНИЕ

В своем обширном и особенно хорошо написанном обзоре (4) Гисберт и Пахарес подчеркнули, что «уникальный и обычно предлагаемый пороговый уровень невозможен, потому что он должен быть адаптирован к различным факторам, таким как тест. прием пищи, доза и тип мочевины или настройки до / после лечения.«Коммерческий набор, который мы используем, имеет определенное пороговое значение разницы в 3,5% Δ для положительности, что находится внутри диапазона 2–5% Δ, в котором наблюдается тенденция к кластеризации большинства результатов дыхательных тестов на мочевину (5,6). Целью этого исследования было оценить разницу в распределении отрицательных и положительных результатов между старым тестом 14 C и новым тестом 13 C. Мы определили, что отрицательные результаты были распределены значительно дальше от порогового значения для тестирования 13 C, чем для тестирования 14 C.Распределение отрицательных результатов было более тесно сгруппировано вокруг среднего отрицательного значения, однако с более длинным левым хвостом, что потенциально объясняет, почему некоторые значения были отрицательными в результате вычитания между исходным уровнем и образцами дыхания после приема пищи.

Кроме того, мы стремились определить, может ли использование категории неопределенных результатов иметь смысл и какой тип результатов должен вызывать повторное тестирование у данного пациента. Гранично-отрицательные результаты действительно возникают при тестировании 13 C, хотя и реже, чем при тестировании 14 C, и мы будем внимательно отслеживать различия между 3.0 и 3,5% Δ.

Многие авторы выступали за использование серой зоны неопределенных результатов для учета присущих вариаций в методике измерения. Опять же, определение этой неопределенной зоны варьировалось между авторами, но довольно небольшое количество пациентов, как правило, попадали в нее (7). Рекомендуется соблюдать осторожность при проведении теста для подтверждения эрадикации H. pylori. Если инфекция сохраняется, более низкая плотность бактерий может снизить ответ теста, а использование более низкого порога отсечки в таких случаях может улучшить обнаружение остаточной инфекции и уменьшить ложноотрицательные результаты (8,9).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

13 Дыхательный тест на содержание C-мочевины точен для выявления инфекции H. pylori . Это безопасно и просто для пациента, обычно дает четко положительные или отрицательные результаты для клинициста и, таким образом, является неинвазивным тестом выбора в этой клинической обстановке.

Интерпретатору всегда рекомендуется проявлять осторожность, чтобы свести к минимуму ложноположительные и отрицательные результаты. Использование неопределенной зоны значений результатов может помочь интерпретатору повысить диагностическую точность теста.

ПРИЛОЖЕНИЕ A: ПОДГОТОВКА К ИССЛЕДОВАНИЮ

13 C ДЫХАНИЕ МОЧИНЫ

Пациент не должен иметь противопоказаний к тесту, должен голодать от жидкости и твердой пищи в течение 6 часов, должен воздержаться от курения в течение 2 часов и должен прекратить прием следующие лекарства:

  • Пероральные или внутривенные антибиотики в течение 30 дней заранее (прием противовирусных и противогрибковых препаратов не требуется).

  • Висмут на 30 дней заранее.

  • Сукральфат за 14 дней заранее.

  • Ингибиторы протонной помпы на 14 дней заранее.

    • Омепразол

    • Лансопразол

    • Декслансопразол

    • Рабепразол

    • Пантопразол

    • Пантопразол

      • Циметидин

      • Ранитидин

      • Фамотидин

      • Низатидин

    • Антациды, отпускаемые без рецепта за 24 часа.

    РАСКРЫТИЕ ИНФОРМАЦИИ

    О потенциальном конфликте интересов, относящемся к этой статье, не сообщалось.

    • Получено для публикации 26 октября 2016 г.
    • Принято к публикации 3 февраля 2017 г.

    Дыхательный тест на мочевину 13 [C] как новый биомаркер для лечения и диагностики туберкулеза

    Аннотация

    Фон

    Патоген-специфические метаболические пути могут быть обнаружены с помощью дыхательных тестов, основанных на введении стабильных изотопно-меченых субстратов и обнаружении меченых продуктов в выдыхаемом воздухе с помощью портативных инфракрасных спектрометров.

    Методология / основные выводы

    Мы проверили, можно ли использовать активность микобактериальной уреазы в таком формате дыхательного теста как основу нового биомаркера и диагностики легочного туберкулеза. Сенсибилизированные новозеландские белые кролики подверглись бронхоскопической инфекции, вызванной либо Mycobacterium bovis , либо Mycobacterium tuberculosis . Кроликов лечили 25 мг / кг изониазида (INH) примерно через 2 месяца после заражения, когда присутствовала значительная полостная патология легких.[ 13 C] мочевину закапывали непосредственно в легкие интубированных кроликов в выбранные моменты времени, анализировали пробы выдыхаемого воздуха и определяли кинетику образования δ 13 CO 2 . Образцы, полученные до инокуляции, служили контрольными образцами для преобразования фона 13 CO 2 в модели кролика. 13 CO 2 , образовавшийся в результате метаболического превращения [ 13 C] -мочевины под действием микобактериальной уреазной активности, легко обнаруживался в выдыхаемом воздухе инфицированных кроликов в течение 15 минут после введения.Анализы показали быстрое увеличение скорости образования 13 CO 2 как на ранней стадии заболевания, так и до лечения INH. После обработки INH все исследуемые кролики показали снижение скорости образования 13 CO 2 .

    Выводы / Значение

    Дыхательный анализ мочевины может обеспечить полезный диагностический и биомаркерный анализ туберкулеза и ответа на лечение. В будущих работах будет проверяться специфичность для M. tuberculosis с использованием ингаляционных препаратов сухого порошка, нацеленного на легкие, в сочетании с одновременным введением пероральных ингибиторов уреазы вместе с насыщающей пероральной дозой немеченой мочевины, что предотвратит δ 13 CO 2 сигнал от уреазо-положительных желудочно-кишечных организмов.

    Образец цитирования: Jassal MS, Nedeltchev GG, Lee JH, Choi SW, Atudorei V, Sharp ZD, et al. (2010) 13 [C] — Дыхательный тест на мочевину как новый биомаркер для лечения и диагностики туберкулеза. PLoS ONE 5 (8): e12451. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0012451

    Редактор: Мадукар Пай, Университет Макгилла, Канада

    Поступила: 6 июня 2010 г .; Одобрена: 26 июля 2010 г .; Опубликовано: 27 августа 2010 г.

    Авторские права: © 2010 Jassal et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Финансирование: Благодарность за поддержку грантов / контрактов Национальных институтов здравоохранения (NIH) AI36973, AI37856, AI30036. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

    Введение

    После долгого перерыва в разработке новых лекарств для лечения туберкулеза (ТБ) такие замечательные соединения, как TMC207 / R207910, PA824 и OPC6768, выходят из доклинических стадий и вступают в клинические испытания с обещанием последуют другие новые соединения [1] — [3]. Однако стало ясно, что существует острая потребность в новых биомаркерах ответа туберкулеза на лекарственную терапию, которые могут служить суррогатами эффективности лекарственного средства для руководства при разработке и проведении этих клинических испытаний [4] — [6].Без таких биомаркеров эти испытания могли бы быть более продолжительными, сложными и дорогостоящими, тем самым задерживая доступность новых лекарств и, возможно, даже препятствуя испытаниям других. Суррогатные биомаркеры особенно важны при планировании фазы IIa / b, где такие вопросы, как дозы лекарств и схема схемы, часто бывают сложными, хотя они могут быть полезны на протяжении всего исследования и за его пределами при мониторинге лечения.

    Потребность в этих новых биомаркерах возникает из-за недостатков текущих конечных точек.В частности, текущий стандарт безрецидивной выживаемости в течение 2 лет после лечения делает испытания долгими и громоздкими, хотя хорошо обоснованные более ранние биомаркеры могут быть приемлемыми для регулирующих органов при определенных обстоятельствах. Идеальные биомаркеры можно было бы быстро и легко использовать даже в условиях относительно невысоких ресурсов, а также вводить и считывать их в месте оказания медицинской помощи. Чтобы быть полезным при разработке и проведении испытаний лекарственных средств, он должен обеспечивать возможность чувствительного и динамического мониторинга лечения микобактериальной нагрузки на протяжении большей части (если не всей) схемы лечения в широком диапазоне групп пациентов, обеспечивая суррогат для всего процесса лечения. гомогенизация органов и определение колониеобразующих единиц (КОЕ), которые могут быть получены только в доклинических исследованиях на животных [4].Три имеющихся в настоящее время биомаркера: положительный результат мазка мокроты, ранняя бактерицидная активность (EBA) или преобразование в отрицательный результат посева мокроты через два месяца — не удовлетворяют этим требованиям, хотя они по-прежнему полезны, а последний также считается биомаркером стерилизующей активности. Хотя суррогаты на основе иммунной системы неоценимы в диагностике, существуют опасения по поводу их полезности для динамического наблюдения за влиянием терапии на бактериальную нагрузку, а также по поводу их использования в популяциях с ослабленным иммунитетом и педиатрии.Кроме того, различия в ответе хозяина и неопределенности во взаимосвязи между КОЕ и ответом биомаркера означают, что эти подходы вряд ли предоставят требуемую информацию.

    Патоген-специфические метаболические пути могут быть быстро обнаружены с помощью дыхательных тестов, основанных на введении нетоксичных изотопно-меченых субстратов и обнаружении меченых продуктов, специфичных для микробного метаболизма в выдыхаемом воздухе. Обнаружение 13 CO 2 в выдыхаемом воздухе особенно привлекательно, поскольку соотношение 13 CO 2 к 12 CO 2 можно легко измерить с помощью масс-спектрометрии или портативных инфракрасных спектрометров.Этот подход был использован для диагностики инфекции Helicobacter pylori и для мониторинга ее ликвидации с помощью медикаментозного лечения [7] с использованием бактериальной уреазы в качестве биомаркера, с изотопным дыхательным тестированием, основанным на введении пациенту напитка с изотопной меткой мочевины и мониторинге выдыхаемого меченого CO2. Весь процесс диагностики может быть завершен в течение примерно 15 минут (например, с использованием теста Breathtek ™ от Otsuka) с использованием портативного инфракрасного устройства обнаружения и стабильных пакетов индикаторов. M. tuberculosis также обладает активной уреазой, используемой в классических микробиологических анализах [8] — [12], а также потенциальным фактором вирулентности, который увеличивает внутриклеточную выживаемость за счет защелачивания микроокружения и предотвращения слияния фагосома-лизосома [13] — [15] ].

    Мы выдвинули гипотезу, что подход, основанный на мониторинге метаболического превращения специфических микобактерий субстрата, меченного стабильными изотопами, в меченый выдыхаемый газ, аналог широко принятого дыхательного теста для Helicobacter pylori , вместе с доставкой меченого субстрата в легкие, позволит обнаружение M.tuberculosis в легком без необходимости получения мокроты или других образцов, которые могут лишь частично отражать все легкое. Кроме того, мы предположили, что степень превращения меченого субстрата в меченые газы зависит от плотности бактерий, и поэтому этот тест может сообщить об общей бактериальной нагрузке и ее реакции на терапию и, таким образом, предоставить полезный биомаркер. Наконец, если в клинических испытаниях новых лекарств будет продемонстрирована прогностическая способность биомаркеров, их можно будет использовать для быстрого мониторинга в местах оказания медицинской помощи и для руководства лечением случаев ТБ, особенно МЛУ / ШЛУ, для которых увеличение затрат на мониторинг будет оправдано улучшением результаты лечения с меньшим количеством неудач [16], [17].

    Чтобы проверить нашу гипотезу, мы использовали модель на животных, которая использует пресенсибилизацию и бронхоскопическую инокуляцию для надежного образования легочных полостей на кроличьей модели туберкулеза [18]. Поскольку с помощью этой модели достигается бактериальная нагрузка, сравнимая с таковой у людей с запущенным легочным туберкулезом, она отражает уровни микобактериальной уреазы у пациентов с туберкулезом. Чтобы управлять легочной специфичностью, индикатор, раствор С-мочевины 13 , вводили непосредственно в дыхательные пути инфицированных животных в различные моменты времени во время инфицирования.Эту модель распределения индикаторов мы могли бы получить, используя систему доставки ингаляционной дозы сухого порошка, которая была бы предпочтительным окончательным вариантом лечения человека, которое мы планируем. Были собраны образцы выдыхаемого воздуха, и соотношение 13 CO 2 / 12 CO 2 было количественно определено с помощью масс-спектрометрии изотопного отношения в выбранном интервале. Приблизительно через 8 недель после заражения изониазид (INH) вводился ежедневно с 14-дневным интервалом. Дыхательный тест проводился в нескольких временных точках как во время лечения, так и после него, чтобы определить, можно ли использовать активность микобактериальной уреазы в качестве быстрого биомаркера легочного туберкулеза и его реакции на терапию.

    Методы

    Заявление об этике

    Все животные содержались в соответствии с протоколом с идентификационным номером RBO8M512, который утвержден Комитетом по уходу и использованию институциональных животных Университета Джона Хопкинса.

    Микроорганизмы

    Культуры получали путем оттаивания аликвот замороженного исходного материала Mycobacterium bovis ( M. bovis ) Ravenel и M. tuberculosis ( M. tb. ) h47Rv. Микобактерии выращивали в жидкой среде 7H9 Миддлбрука с добавлением олеиновой кислоты, альбумина, декстрозы и каталазы (Becton Dickinson, Inc., Sparks, MD), 0,5% глицерина и 0,05% Твина 80.

    Уреазная активность

    Культуры M. tb. CDC 1551, M. bovis BCG и два мутанта с дефицитом уреазы (M. tb. CDC 1551 Δ ure B и Δ ure D) культивировали в жидкой среде 7H9 Middlebrook и разводили до 10 3 КОЕ. / мл в соответствии со спецификациями тестовой среды. Активность уреазы измеряли с использованием набора BD BBL ™ Taxo ™ Differentiation Disc Urea Kit (Becton Dickinson, Inc., Sparks, MD). Колориметрические изменения отслеживали через один и три дня после введения диска мочевины.Измерения оптической плотности проводили при OD 550 нм после 3 дней инкубации с дисками мочевины. Специфичность активности уреазы была нормализована к количеству КОЕ во время расчета оптической плотности (Рисунок S1).

    Животные

    6 беспатогенных беспородных новозеландских белых кроликов (2,5–3,5 кг) были получены от Covance Research Products, Inc. (Денвер, Пенсильвания). Животных содержали в условиях 3-го уровня биобезопасности в стандартных клетках. Всех кроликов сенсибилизировали каждые 3-4 дня путем пяти подкожных инъекций 10 7 убитых нагреванием M.bovis в неполном адъюванте Фрейнда. Успешное приобретение реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) было предпринято через 25 дней после последней сенсибилизирующей инъекции путем внутрикожной инъекции 0,1 см3 старого туберкулина (Synbiotics Corp, Канзас-Сити, Миссури). Через 48–72 часа измеряли туберкулиновую реакцию и измеряли толщину кожной складки в двух измерениях. Результаты рассчитывались по формуле объема овального сфероида.

    Инфекция и клиническая оценка

    Животных успокаивали кетамином (15-25 мг / кг) и ксилазином (5-10 мг / кг).Снятие седативного эффекта было достигнуто с помощью йохимбина (0,1–0,2 мг / кг). Инфекцию вводили путем закапывания жидких инокулятов через 3,0 мм гибкий бронхоскоп Pentax FB-8V детский бронхоскоп (Pentax Medical Company, Montvale, NJ) в субсегментарные бронхи правой средней доли. Бациллярная суспензия объемом 0,3 куб. См, содержащая 10 3 –10 4 КОЕ, была доставлена ​​через порт для введения бронхоскопа. Подтверждение количества доставленных КОЕ выполняли путем посева серийных разведений инокулированной суспензии, как описано выше.После заражения за животными дважды в неделю наблюдали клинический внешний вид, ректальную температуру и вес.

    Противомикробные препараты

    Изониазид (INH) был получен и приготовлен для внутримышечного (IM) введения. 25 мг / кг INH вводили внутримышечно в течение 2 недель примерно через восемь недель после бронхоскопической инфекции.

    Отбор проб дыхания мочевины

    Суспензию 40–50 мг меченой 13 [C] мочевины (100 мг / мл) закапывали через питательную трубку с малым диаметром, вводимую через 4.Эндотрахеальная трубка 0 мм. Питательный зонд выдвинули на уровень киля или немного за устье правого главного бронха. После закапывания мочевины животных держали в положении лежа на спине с подъемом головы на 45 градусов для улучшения распределения жидкости в нижних зонах легких. В установленные моменты времени (5 минут, 10 минут и 20 минут) после инстилляции изотопной мочевины через эндотрахеальную трубку вводили питательную трубку 14-Френч до уровня киля. Шприц объемом 10 см3, прикрепленный к питательной трубке, отбирал пробы воздуха, при этом время от времени выполнялись маневры принудительного выдоха (т.е. нежное сдавливание грудной клетки). Затем отобранный воздух вводили через фильтр 0,35 мкм в Vacutainer объемом 6,0 мл с красной крышкой (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Эти процедуры отбора проб воздуха проводились до бактериального заражения и в определенные моменты времени после заражения. В каждый момент времени были получены базовые пробы окружающего воздуха с окружающей средой 13 CO 2 и 12 CO 2 .

    Измерение

    13 CO 2 Преобразование

    3 мл 0.Образец выдыхаемого воздуха, отфильтрованный 2 микронами, переносили в 10 мл герметичную пробирку, содержащую газообразный гелий, и анализировали с помощью масс-спектрометрии изотопного состава газа с использованием прибора Delta plus XL для обогащения 13 C в свободном пространстве CO 2 . Обогащение 13 C CO 2 13 CO 2 ) указано в дельта-нотации, где дельта-значение указано в ‰ следующим образом: где R — это отношение содержания Для тяжелого и легкого изотопа x обозначает образец, а std — это сокращение от стандарта Vienna Pee Dee Belemnite (VPDB).Воспроизводимость при δ 13 C была лучше 0,1 ‰. Было обнаружено, что значения δ 13 CO 2 линейно увеличиваются со временем после введения мочевины, и поэтому эти значения были линейно аппроксимированы, и было оценено увеличение δ 13 CO 2 в минуту.

    Вскрытие трупа

    Кроликов наблюдали в течение как минимум 50 дней после заражения. Эвтаназию проводили, если животные проявляли какие-либо признаки респираторной недостаточности и / или значительную потерю веса (более 200 г).Кроликов умерщвляли внутривенным введением эвтазола (Virbac Corporation, Форт-Уэрт, Техас). Образцы были взяты из легких и внелегочных тканей. Образцы полости, если применимо, представляли содержимое просвета, стенку и окружающую воспалительную ткань. Внелегочные участки включали селезенку, печень, почки (двусторонние), мочу, кал, пейеровы пятна в тонкой кишке.

    Оценка макропатологии и гистопатологии полости

    Выявленные первичные поражения легких в правой нижней доле и вторичные поражения ипсилатеральных и контралатеральных легких оценивались в соответствии с их распространенностью.Явно видимые внелегочные поражения оценивали в соответствии с их распространенностью и локализацией. Срезы тканей заливали парафином и окрашивали гематоксилином и эозином. Все слайды исследовали с помощью Nikon Microscope Eclipse E800 (Nikon Instruments Inc., Мелвилл, Нью-Йорк).

    Подсчет бактериальных КОЕ

    Было измерено

    КОЕ во всех заранее определенных легочных и внелегочных точках у каждого инфицированного кролика. Образцы тканей из каждого сайта гомогенизировали и высевали на селективный агар 7h21, как описано выше.Подсчет КОЕ производился на 14, 21 и 28 дни.

    Статистика

    SigmaStat 3.0 использовался для определения статистических значений, используя Anova и t-критерий, значение p 0,05 или меньше, указывающее на значимость

    Результаты

    Исследования in vitro

    Важна линейность потенциального биомаркера с подсчетом КОЕ, поэтому M. bovis BCG , вакцинный штамм M. tuberculosis , инкубировали с 13 C-меченой мочевиной и анализировали газ из свободного пространства через 30 минут для δ 13 CO 2 (обогащение CO 2 в свободном пространстве 13 CO 2 ) и результаты типичного эксперимента, показанные на рисунке 1.Можно видеть, что δ 13 CO 2 увеличивалось линейно с КОЕ более чем на 2 порядка величины, и что наклоны (степень преобразования на 10 6 КОЕ) для разных экспериментов были одинаковыми (данные не показано). Важно отметить, что обнаружение было возможно на уровнях 10 4 КОЕ мл -1 , что значительно ниже, чем большинство наблюдаемых уровней в мокроте, которые наблюдаются в диапазоне от 10 6 до 10 8 КОЕ мл -1 в исследованиях EBA, так что существует потенциал для большой чувствительности (17).

    Рисунок 1. Анализ микобактериальной уреазы путем преобразования [ 13 C] мочевины в 13 CO 2 сообщает о КОЕ в широком диапазоне.

    M. bovis BCG инкубировали в течение 30 минут с 5 мг / мл -1 [ 13 C] -мочевины и газа, отобранного и проанализированного на предмет обогащения 13 CO 2 (указано как δ 13 СО 2 ).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0012451.g001

    Различные патологии легких после пресенсибилизации и бронхоскопической инфекции

    Каждый кролик был эффективно сенсибилизирован убитым нагреванием M. bovis , и все кожные туберкулиновые пробы были преобразованы в положительные до заражения аналогично предыдущей работе (Таблица 1) (18). Даже Кролик B1, , у которого показал наименьшую реактивность кожной пробы, успешно сформировал полость в легких. Была отмечена различная макроскопическая патология с использованием прямой бронхоскопической инфекции в правой средней доле (рис. 2).У обоих кроликов Т1 и Т2, инфицированных M. tuberculosis h47Rv, не развивались полные полостные поражения. У кролика Т1 развилось диффузное гранулематозное заболевание, которое было наиболее выражено в начальном очаге инфекции в правой средней доле. При вскрытии правой средней и нижней долей никаких признаков разжижения или казеоза не обнаружено. Подсчет КОЕ от кролика Т1 дало более 10 6 бацилл из правого легкого и немного больше 1,5 log с контралатеральной стороны (Таблица S1).У кролика Т2 наблюдалась минимальная гранулематозная болезнь с очагами некроза. Вскрытие трупа кролика осложнилось диффузным легочным кровотечением после интубации. Легкие были сильно переполнены множественными сгустками, обнаруженными в двусторонней сосудистой сети легких. При посеве различных образцов из двусторонних срезов легких кролика Т2 не было обнаружено никаких наблюдаемых КОЕ.

    Кролики B1, B2, B3 и B4 были инфицированы M. bovis . Все образовались полостные поражения, за исключением кролика B4 (рис. 2).Наибольшее общее количество КОЕ было измерено во внутреннем содержимом полостей B1 и B3, что дало более 10 8 бацилл (Рисунок S2). Кролик B2 содержал приблизительно на 0,3 log больше КОЕ в правом легком по сравнению с жидким казеумом. Контралатеральное распространение в левое легкое было отмечено у всех полостных кроликов. Кролик B4 не развил полостного поражения, но заметное гранулематозное заболевание, изолированное на двусторонних верхних долях, было оценено. Образцы с двусторонних срезов дали КОЕ только из правого легкого.Таким образом, животные демонстрировали ряд патологий, и, таким образом, их использование представляло собой реалистичную проверку потенциального успеха подхода в аналогичной человеческой популяции.

    Бактериальные корреляты фенотипа заболевания: внелегочное распространение

    M. bovis , но не M. tuberculosis

    В отличие от инфекций M. tuberculosis , кроликов, инфицированных M. bovis , однозначно продемонстрировали распространение бактерий во внелегочные органы, что согласуется с нашими предыдущими исследованиями кавитации в легких (Рисунок S3).Кролики B1 и B3 имели заметное количество КОЕ в селезенке. Количество КОЕ в почках превышало 2,5 логарифмических единиц у всех кроликов, инфицированных M. bovis , за исключением B1. Количество КОЕ в почках было примерно на 1 log больше, чем в селезенке. На поверхности почек были отмечены явно видимые гранулемы. Внелегочное распространение M. tuberculosis не наблюдалось ни при макроскопической патологии, ни при микробиологической оценке. Как штамм M. tuberculosis, h47Rv, так и штамм M.Штамм bovis Ravenel был протестирован на уреазную активность с помощью дискового анализа мочевины и оказался строго положительным (Рисунок S1).

    Диагностическая ценность дыхательного теста на мочевину у туберкулезных кроликов

    Всем кроликам перед бронхоскопической инфекцией был проведен анализ дыхания на мочевину, и на исходном уровне была отмечена определенная ферментативная конверсия [ 13 C] -мочевины. Увеличение δ 13 CO 2 после введения мочевины наблюдалось примерно в соответствии с линейной кинетикой в ​​течение 20 минут (типичный пример постинфекционного случая на Фигуре 3, поэтому они были адаптированы для обеспечения скорости увеличения δ 13 CO 2 минут −1 .Степень конверсии δ 13 CO 2 минут -1 находилась в диапазоне от 0,1 до 0,2 [на мил единиц в минуту] (Фиг.4). Увеличение сигналов UBT наблюдалось у всех исследуемых кроликов (с предполагаемым более низким числом КОЕ) в течение диапазона дней, в течение которых дыхательный тест был первоначально проведен после заражения, 42–62 дня (рис. 4). Все коэффициенты конверсии после заражения превышали 0,2 [на мил единиц в минуту]. Кролики с наиболее выраженной патологией легких показали наибольший выявляемый сигнал δ 13 CO 2 .Кролик B4 имел наименьшее количество видимых патологий при аутопсии (двусторонние гранулемы верхней доли) и наименьший коэффициент конверсии. Кролик B4 имел приблизительно 3 log КОЕ / мл, заметных в правом легком, и может служить в качестве возможной основы для определения нижнего предела обнаружения КОЕ (рис. 2). Кролик T1 с многочисленными двусторонними гранулемами и отсутствием полостной болезни при вскрытии имел самый высокий выявляемый δ 13 CO 2 после инфицирования.

    Рис. 4. Коэффициент конверсии [ 13 C] -мочевины до и после лечения INH.

    Исходный уровень конверсии [ 13 C] -мочевины был получен у всех животных до бронхоскопической инфекции. Коэффициенты конверсии мочевины были получены в единственном временном пункте через 4–8 недель после заражения. INH 20 мг / кг в день с интервалом в 2 недели был начат через 8 недель с момента заражения. Показатели конверсии определялись либо во время, либо в течение 10 дней после прекращения лечения. Конверсию уреазы, наконец, определяли в единичные временные точки через 2–4 недели и через 6–8 после лечения у отобранных кроликов.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0012451.g004

    Дыхательный анализ мочевины как маркер ответа на лечение у туберкулезных кроликов

    INH (25 мг / кг) вводили ежедневно в течение 14-дневного интервала всем кроликам, кроме B1. Кролик B1 был умерщвлен перед лечением из-за значительного респираторного расстройства, наблюдавшегося до периода лечения. Степень превращения [ 13 C] -мочевины тестировалась во время лечения для всех кроликов, за исключением B1 и B2 (Таблица 1).Во время и / или в течение 2 недель после лечения отмечалось снижение конверсии меченой мочевины у всех испытанных животных. У кролика T1 было самое резкое снижение определяемого δ 13 CO 2 .

    Через 2 недели после лечения было отмечено повышение δ 13 CO 2 у кролика T2. Хотя при вскрытии не было обнаружено наблюдаемых количеств КОЕ, минимальная макроскопическая патология была оценена. Это продолжающееся повышение активности уреазы было отмечено через 8 недель после инфицирования у кролика Т2.У кроликов B3 и B4 коэффициент конверсии значительно снизился через 2 недели после лечения INH. Кролик B3 показал определяемое значение δ 13 CO 2 через 4 недели после лечения, вероятно, из-за высокой бактериальной нагрузки в развитой полости легких. У кролика B4 наблюдались поражения только верхних отделов легких, и через 4 недели после прекращения лечения отмечалось продолжающееся снижение коэффициента конверсии. Кролик B2 не обнаруживал уреазу через 2 недели после лечения. Однако тестирование, проведенное через 4 недели после лечения, показало продолжающееся повышение определяемого значения δ 13 CO 2 .Продолжающийся рост конверсии уреазы у кролика B2, как и у кролика B3, может быть объяснен образованием значительного полого поражения с высокой бактериальной нагрузкой (рис. 2). Только кролик Т2 имел временные точки дальше 4 недель после лечения. Совокупные данные по всем животным, отмеченным после инфицирования, продемонстрировали значительное увеличение средней степени конверсии δ 13 CO 2 (фиг. 5), которая значительно снизилась после лечения.

    Рис. 5. Средняя скорость преобразования [ 13 C] -мочевины в минуту среди M.tuberculosis h47Rv и M. bovis -инфицированные кролики.

    Повторные измерения проводились для каждого образца дыхательного теста. Значительные различия в скорости конверсии отмечаются как после инфицирования, так и после лечения 25 мг / кг INH. Коэффициенты были получены до инфицирования, через 4–8 недель после бронхоскопической инфекции и в течение двух недель после лечения INH.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0012451.g005

    Обсуждение

    Результаты этого исследования предполагают, что доставка [ 13 C] -мочевины в легкие кроликов, инфицированных микобактериями, продуцирующими уреазу, может быть использована в качестве диагностического метода для оценки тяжести заболевания легких и их реакции на терапию. .У кроликов, инфицированных M. tuberculosis и M. bovis , наблюдается значительный рост скорости образования δ 13 CO 2 до лечения, которая снижалась после терапии INH. Хотя повышение конверсии мочевины наиболее заметно наблюдалось у кроликов с полостной или диффузной патологией легких, оно было заметно даже у кроликов с наибольшим количеством локализованных заболеваний (инфекция в правой средней доле, как видно у кроликов T1 и T2), так что подход, казалось бы, применим в широком смысле.Улучшенные схемы доставки в легкие, возможные с помощью ингаляторов сухого порошка, могут еще больше улучшить этот аспект.

    Уреаза присутствует в большинстве патогенных микобактерий, включая M. tuberculosis и M. bovis [19]. Присутствие уреазы в микобактериях было впервые отмечено Зенгеном в 1913 г. и подтверждено Корпером и Свини в 1918 г. [20] — [22]. Тестирование основывалось на способности фермента разлагать мочевину на CO 2 и NH 3 , последний из которых послужил основой для классификации бактерий.Toda et al. уточнил классификацию микобактерий по уреазной активности за счет разработки методики быстрого колориметрического бульона [8]. Спустя годы последовало дальнейшее развитие экспресс-тестирования на основе уреазы, в котором использовались тестовые диски с залитой мочевиной и модифицированные радиометрические приборы BACTEC [11], [12]. Со времени последних крупных публикаций по диагностике на основе уреазы в 1970-х годах после обширного обзора литературы не было отмечено никаких дальнейших работ, посвященных этой теме.Наша работа основана на объединении этого классического подхода к классификации микобактерий и более поздних тестов на основе уреазы для диагностики H. pylori .

    Дыхательный анализ мочевины (UBT) для H. pylori включает пероральный прием [ 14 C] — или [ 13 C] -мочевины и оценку δ 14 CO 2 или δ 13 CO 2 через образцы выдыхаемого воздуха. Эта чувствительная диагностика теперь обычно используется как экспресс-тест H.pylori [7], [22]. Наша модель содержит важную модификацию H. pylori UBT в том, что вместо пероральной доставки меченой мочевины мы использовали прямое внутрилегочное введение нерадиоактивного индикатора, доставляя тестируемый агент в интересующую область. После инстилляции соединения мочевины побочных эффектов со стороны дыхательных путей не отмечалось. Нацеленная на легкие доставка [ 13 C] -мочевины с помощью ингаляторов сухого порошка будет представлять нашу доставку для будущих исследований на людях, в которых потребуется более эффективное диффузное отложение исследуемого агента в легких [23].

    Наша модель потенциально предлагает путь к новой диагностике ТБ и лечению ТБ по месту оказания медицинской помощи. Диагностика по месту оказания медицинской помощи крайне необходима в условиях тяжелого бремени, чтобы сократить задержки в выявлении заболевания и ускорить распознавание неудач лечения, свидетельствующих о лекарственно-устойчивом туберкулезе [24]. Задержки в диагностике, которые характерны для некоторых современных средств диагностики ТБ, могут быть напрямую связаны с неспособностью контролировать эпидемию [25] — [27]. Скорость преобразования в минуту показывает, что тест может быстро и надежно выявить туберкулез легких, связанный с различными патологическими проявлениями.У животных, участвовавших в нашем исследовании, наблюдались не только полостные поражения, но также диффузная гранулематозная болезнь и отдельные гранулемы верхней доли. Несмотря на вариабельность тканевого заболевания, каждое животное показало значительное повышение δ 13 CO 2 после заражения. Разработанный тест соответствует критериям эффективной диагностики в месте оказания медицинской помощи, для чего требуется легко внедряемая, экономичная и быстро применяемая технология. Анализ изотопного газового отношения теперь можно проводить с помощью компактных инфракрасных спектрофотометров, таких как POCone ™ (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Токио, Япония). Выдыхаемый воздух можно просто получить через мешки с односторонним клапаном и проанализировать в этом устройстве.

    Наша модель также предоставляет новый биомаркер для испытаний лекарственной терапии туберкулеза. Активно ведется поиск биомаркеров для улучшения терапевтических стратегий и проверки новых противотуберкулезных препаратов и вакцин-кандидатов [4], [6]. INH давали ежедневно в течение 2 недель 5 кроликам, у 4 из которых были измерены временные точки после периода приема лекарств. У всех четырех кроликов коэффициент конверсии δ 13 CO 2 снизился при тестировании непосредственно перед 2 неделями после лечения.Продолжающееся снижение показателей конверсии было отмечено у кролика B4, у которого наблюдалась исключительно двусторонняя гранулематозная болезнь верхней доли. Было продемонстрировано лечение такого минимального заболевания с помощью 2-недельного курса изониазида при продолжающемся снижении показателей конверсии. Адаптация этого теста к людям может позволить проводить серийный мониторинг биомаркера легочных КОЕ во время лечения и предоставлять ценную раннюю информацию о том, реагирует ли бактериальная нагрузка на противомикробную терапию. Дыхательный анализ может позволить получить полезную информацию в течение нескольких минут, чтобы определить, чувствительны ли бациллы туберкулеза к применяемому режиму приема лекарств.В отличие от применяемых в настоящее время анализов мокроты или молекулярных анализов, используемых для определения лекарственной чувствительности, дыхательный тест на мочевину M. tuberculosis позволит быстро подтвердить эффективность лечения и необходимость в модификациях лечения лекарственно-устойчивого туберкулеза [28], [29].

    Стоит отметить, что подробно описанный здесь подход потенциально может быть гораздо более быстрым и простым в применении, чем классические исследования EBA для определения полезности химиотерапевтического агента, поскольку не требуется 3-4-недельные культуры на КОЕ.Также существует возможность избежать некоторых известных недостатков EBA — необходимости обширного сбора мокроты, сбора, ограниченного отбора образцов из места образования мокроты (в отличие от всего легкого) и возможности бактериального и / или грибкового заражения культур [ 30]. В исследованиях EBA оценивается ранняя фаза лечения ТБ, на которой оценивается способность препарата уничтожать метаболически активные бациллы [31]. Однако оценка последней стерилизационной фазы лечения вызвала большие споры.Расширенные исследования EBA (дни 2–14 лечения), к сожалению, не зарекомендовали себя в качестве значимого суррогатного маркера для определения стерилизующей активности [32], [33]. В настоящее время традиционная двухмесячная конверсия культуры — это наиболее часто используемый метод, используемый в качестве маркера стерилизации [34]. Наш тест успешно обнаружил бактерицидную активность INH, который был активен против многочисленных активно реплицирующихся бацилл у наших полостных кроликов в течение 14-дневного интервала времени. Будущие эксперименты по определению полезности этого подхода будут включать использование стерилизующих препаратов (т.е. рифампицин, пиразинамид и т. д.) в течение заданного временного интервала, чтобы также определить значение дыхательного теста на мочевину в качестве маркера стерилизационной активности.

    Наше исследование было ограничено возможным отсутствием специфичности, положительным исходным сигналом, вызванным другими видами микробов, продуцирующих уреазу (такими как отдельные виды Pseudomonas, Klebsiella, нетуберкулезные микобактерии и H. pylori ) [35], [36] ]. Этот организм имеет особое значение для будущей работы по трансляции, учитывая, что инфицировано около 50% населения мира, а самые высокие показатели наблюдаются в развивающихся странах [37].Большинство видов Helicobacter быстро выводятся из организма при лечении рифампицином, и поэтому серийные измерения UBT у пациентов, получавших рифампицин (например, в ранних испытаниях препарата у уже леченных пациентов), могут не показать долгосрочную ложноположительную реакцию из-за эндогенного носительства Helicobacter . [38], [39].

    Однако более широкое распространение потребует решения этой потенциальной проблемы. Можно было бы комбинировать ингаляцию меченой мочевины у людей (чтобы управлять легочной специфичностью доставки индикаторов) с пероральной терапией, которая включает ингибиторы уреазы Helicobacter, такие как соли висмута (т.е. Pepto-Bismol®) или ингибиторы протонной помпы или литоостат для подавления активности уреазы GI и возможного искажения данных [40], [41]. Дополнительный подход может заключаться в совместном введении напитка с мочевиной (аналогично подходу Breathtek для H. pylori ), который не обогащен 13 C, а скорее имеет его в нормальном количестве: следовательно, образуется любой CO 2 кишечные организмы не будут обогащены 13 CO 2 и, таким образом, не будут искажать сигнал из легких.Наконец, у людей измерения можно проводить быстро после ингаляции мочевины, до того, как мочевина может достичь кишечника, преобразоваться в CO 2 и затем выдохнуть. Такие подходы легче всего протестировать и внедрить в клинических испытаниях новых лекарств, где инфраструктура поддержки и характеристики пациентов будут намного выше, чем в полевых условиях, и успех там позволит их более широко применять.

    Таким образом, в этом исследовании описывается новое использование дыхательного теста [ 13 C] -мочевины в качестве биомаркера диагностики и лечения ТБ с использованием доставки индикатора в легкие.Значительное повышение δ 13 CO 2 было отмечено через 6 недель после инфицирования у всех кроликов, у которых наблюдались различные легочные патологии. Изменение скорости конверсии через две недели ежедневной терапии изониазидом также было оценено у выбранных кроликов в течение 2 недель после лечения. Этот экспериментальный подход может иметь важные последствия для будущего развития диагностики в местах оказания медицинской помощи, мониторинга лечения и тестирования новых противотуберкулезных препаратов.

    Дополнительная информация

    Таблица S1.

    Среднее логарифмическое значение КОЕ в легких, селезенке и почках при аутопсии для всех кроликов. Множественные образцы правого легкого (очаг инфекции), левого (контралатерального) легкого, стенки полости, казеозного полого материала, ткани селезенки и почек были взяты из областей с наиболее выраженной макроскопической патологией. Логарифмическое количество КОЕ / грамм ткани определяли после гомогенизации ткани и разведений при посеве. M. bovis. инфицированных кроликов проявляли наибольшую внутрилегочную и внелегочную патологию.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0012451.s001

    (0,03 МБ DOC)

    Рисунок S1.

    Уреазная активность некоторых видов Mycobacterium. (A) Дифференциация наблюдаемой уреазной активности была проведена для M. bovis, BCG, M. tb. CDC 1551 и двух мутантов с дефицитом уреазы ( M. tb. CDC 1551 Δ ureB и Δ ureD ). Колориметрические изменения наблюдали визуально через один и три дня после инокуляции диском, залитым мочевиной.(B) Измерения оптической плотности проводили через 3 дня инкубации с дисками мочевины, и специфичность уреазной активности нормализовали по количеству КОЕ.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0012451.s002

    (0,18 МБ TIF)

    Рисунок S2.

    Среднее количество КОЕ в легких при вскрытии у поддающихся оценке кроликов, инфицированных M. bovis . Множественные образцы ткани правого (очаг инфекции) и левого (контралатерального) легкого были взяты из участков с наиболее выраженной макроскопической патологией.Также были получены образцы материала стенки полости и казеозного содержимого просвета. Логарифмическое количество КОЕ / грамм ткани определяли после гомогенизации ткани и разведений при посеве. На графике показаны кролики, подлежащие только оценке, с обнаруживаемыми КОЕ во всех тканях легких. Дополнительная информация находится в Таблице S1.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0012451.s003

    (0,07 МБ TIF)

    Рисунок S3.

    Среднее количество КОЕ в селезенке и почках при аутопсии. Множественные образцы почек и селезенки были взяты из тканей с наиболее выраженной макроскопической патологией.Логарифмическое количество КОЕ / грамм ткани определяли после гомогенизации ткани и разведений при посеве. Дополнительная информация находится в Таблице S1. Как отмечалось в предыдущих опубликованных экспериментах, M. tuberculosis, h47Rv не продемонстрировал признаков внелегочного распространения по сравнению с M. bovis 24 .

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0012451.s004

    (0,05 МБ TIF)

    Благодарности

    Авторы благодарят Джонатана Осборна за его щедрую помощь в экспериментах на животных.

    Вклад авторов

    Задумал и спроектировал эксперименты: MSJ GGN VD GT WRB. Проведены эксперименты: MSJ GGN JHL SWC VA GT. Проанализированы данные: MSJ GGN JHL ZS GT WRB. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: MSJ GGN ZS VD GT. Написал статью: MSJ GGN GT WRB.

    Список литературы

    1. 1. Андрис К., Верхассельт П., Гиллемон Дж., Гельманн Х.В., Нифс Дж. М. и др. (2005) Диарилхинолиновый препарат, активный в отношении АТФ-синтазы Mycobacterium tuberculosis.Наука 14: 223–227.
    2. 2. Стовер С.К., Уорренер П., ВанДевантер Д.Р., Шерман Д.Р., Арайн Т.М. и др. (2000) Низкомолекулярный нитроимидазопиран-кандидат для лечения туберкулеза. Nature 405: 962–966.
    3. 3. Мацумото М., Хашизумэ Х, Томисигэ Т., Кавасаки М., Цубучи Х. и др. (2006) OPC-67683, производное нитродигидроимидазооксазола с многообещающим действием против туберкулеза in vitro и у мышей. PLoS Med 3: e466.
    4. 4. Perrin FM, Lipman MC, McHugh TD, Gillespie SH (2007) Биомаркеры ответа на лечение в клинических испытаниях новых противотуберкулезных агентов.Lancet Infect Dis 7: 481–490.
    5. 5. Wallis RS, Doherty TM, Onyebujoh P, Vahedi M, Laang и др. (2009) Биомаркеры активности туберкулеза, лечения и рецидива. Lancet Infect Dis 9: 162–172.
    6. 6. Вальцл Г., Ронахер К., Джоба Сиавая Дж. Ф., Докрелл Х. М. (2008) Биомаркеры для ответа на лечение ТБ: проблемы и будущие стратегии. J Заражение 57: 103–109.
    7. 7. Белл Г.Д., Вейл Дж., Харрисон Дж., Морден А., Джонс PH и др. (1987) 14 Дыхательный анализ C-мочевины, неинвазивный тест на Campylobacter pylori в желудке.Ланцет 1: 1367–1368.
    8. 8. Toda T, Hagihara Y, Takeya K (1961) Простой тест на уреазу для классификации микобактерий. Am Rev Respir Dis 83: 757–761.
    9. 9. Уэйн Л.Г. (1974) Простые тесты на пиразинамидазу и уреазу для рутинной идентификации микобактерий. Am Rev Respir Dis 109: 147–151.
    10. 10. Murphy DB, Hawkins JE (1975) Использование тестовых дисков уреазы для идентификации микобактерий. J Clin Microbiol 1: 465–468.
    11. 11.Cox FR, Cox ME, Martin JR (1977) Быстрый уреазный тест на микобактерии: предварительные наблюдения. J Clin Microbiol 5: 656–657.
    12. 12. Damato JJ, Collins MT, McClatchy JK (1982) Тестирование уреазы микобактерий с помощью радиометрических приборов BACTEC. J Clin Microbiol 15: 478–480.
    13. 13. Опекун А.Р., Готшалл А.Б., Абдалла Н., агент С, Торрес Э. и др. (2005) Улучшенный инфракрасный спектрофотометр для стационарного пациента 13 Дыхательный анализ C-мочевины в учреждениях первичной медико-санитарной помощи.Clin Biochem 38: 731–734.
    14. 14. Hart PD, Young MR (1991) Хлорид аммония, ингибитор слияния фагосома-лизосома в макрофагах, одновременно индуцирует слияние фагосома-эндосома и открывает новый путь: исследования патогенных микобактерий и непатогенных дрожжей. J Exp Med 174: 881–889.
    15. 15. Эль-Нуджуми AM, Dorrian CA, Cittajallu RS, Neithercut WD, McColl KE (1991) Эффект ингибирования активности уреазы Helicobacter pylori ацетогидоксамовой кислотой на гастрин сыворотки у субъектов с язвой двенадцатиперстной кишки.Кишечник 32: 866–870.
    16. 16. Дэвис П.Д., Пай М. (2008) Диагноз и неправильный диагноз туберкулеза. Int J Tuberc Lung Dis 12: 1226–1234.
    17. 17. Gillespie SH, Charalambous BM (2003) Новый метод оценки антимикробной активности схемы лечения туберкулеза. Int J Tuberc Lung Dis 7: 684–689.
    18. 18. Недельчев Г.Г., Рагхунанд Р.Р., Джассал М.С., Лун С., Ченг QJ и др. (2009) Внелегочное распространение Mycobacterium bovis, но не Mycobacterium tuberculosis в бронхоскопической модели полостного туберкулеза на кроликах.Заражение иммунной 77: 598–603.
    19. 19. Нарделл Э.А., Писсенс В.Ф. (2000) Передача туберкулеза при туберкулезе: комплексный международный подход. ФУНТ. Райхман и Э. Hershfield Ed. С. 215–240. (Марсель Деккер, Нью-Йорк.
    20. 20. Канетти Дж. (1995) Туберкулезная палочка (Springer Publishing Company, Inc., Нью-Йорк.
    21. 21. Леви-Фребо В.В., Портаэлс Ф. (1992) Предложил минимальные стандарты для рода Mycobacterium и для описания новых медленнорастущих видов Mycobacterium.Int J Syst Bacteriol 42: 315–323.
    22. 22. Söhngen NL (1913) Benzen, petroleum, paraffinol un parafin als kohlenstoff und engiequell fur mikroben. Збл Бакт Хиг 37: 595–609.
    23. 23. Mitchell JP, Nagel MW (2009) Оральная ингаляционная терапия: решение проблемы разработки устройств, более подходящих для пациентов. Expert Rev Med Devices 6: 147–155.
    24. 24. Пай М., Миньон Дж., Стейнгарт К., Рамзи А. (2010) Новые и улучшенные средства диагностики туберкулеза: доказательства, политика, практика и влияние.Curr Opin Pulm Med 16: 271–284.
    25. 25. Millen SJ, Uys PW, Hargrove J, van Halden PD, Williams BG (2008) Влияние задержек диагностики на процент выбывания и общую задержку диагностики туберкулеза. PloS One 3: e1933.
    26. 26. Dowdy DW, O’Brien MA, Bishai D (2008) Экономическая эффективность новых диагностических инструментов для диагностики туберкулеза. Int J Tuberc Lung Dis 12: 1021–1029.
    27. 27. Гетахун Х., Харрингтон М., О’Брайен Р., Нанн П. (2007) Диагностика туберкулеза легких с отрицательным мазком мокроты у людей с ВИЧ-инфекцией или СПИДом в условиях ограниченных ресурсов: информирование о срочных изменениях политики.Ланцет 369: 2042–2049.
    28. 28. Гранджин Л., Мур Д. (2008) Туберкулез в развивающемся мире: последние достижения в диагностике с особым вниманием к туберкулезу с широкой лекарственной устойчивостью. Curr Opin Infect Dis 21: 454–461.
    29. 29. Хелб Д., Джонс М., История Е, Беме С., Уоллес Е. и др. (2010) Быстрое обнаружение микобактерий туберкулеза и устойчивости к рифампицину с помощью технологии «по требованию» рядом с пациентом. J Clin Microbiol 48: 229–237.
    30. 30.Дональд PR, Diancon AH (2008) Ранняя бактерицидная активность противотуберкулезных препаратов: обзор литературы. Tuberculosis (Edinb) 88: Suppl 1S75–83.
    31. 31. Митчисон Д.А. (1992) Понимание химиотерапии туберкулеза: современные проблемы. J Antimicrob Chemother 29: 477–493.
    32. 32. Бурман WJ (2003) Охота за неуловимым суррогатным маркером стерилизующей активности при лечении туберкулеза. Am J Respir Crit Care Med 167: 1299–1301.
    33. 33. Jindani A, Dore CJ, Mitchison DA (2003) Бактерицидная и стерилизующая активность противотуберкулезных препаратов в течение первых 14 дней. Am J Respir Crit Care Med 167: 1348–1354.
    34. 34. Mitchison D (1993) Оценка новых стерилизующих препаратов для лечения туберкулеза легких путем посева через 2 месяца. Am Rev Respir Dis 147: 1062–1063.
    35. 35. Steadham JE (1979) Надежный тест на уреазу для идентификации микобактерий. J Clin Microbiol 10: 134–137.
    36. 36. Розенштейн И. Дж., Гамильтон-Миллер Дж. М. (1984) Ингибиторы уреазы химиотерапевтических агентов. Crit Rev Microbiol 11: 1–12.
    37. 37. Go MF (2002) Естественная история и эпидемиология инфекции Helicobacter pylori. Алимент Pharmacol Ther 16: 3–15.
    38. 38. Фудзимура С., Като С., Кавамура Т., Одзава К., Абэ Т. и др. (2002) Влияние рифампицина на распространенность Helicobacter pylori у пациентов с микобактериальной инфекцией. Eur J Gastroenterol Hepatol 10: 1161–1162.
    39. 39. Санака М., Куяма Ю., Яманака М., Ивасаки М. (1999) Снижение сывороточных концентраций антител IgG к Helicobacter pylori во время противотуберкулезной терапии: возможное искоренение рифампицином и стрептомицином. Am J Gastroenterol 7: 1983–1984.
    40. 40. Buzás GM, Széles I (2008) Интерпретация дыхательного теста с C-мочевиной 13 при выборе второй и третьей линии эрадикации инфекции Helicobacter pylori. J Gastroenterol 43: 108–114.
    41. 41. Uygun A, Kadayifci A, Safali M, IIgan S, Bagci S (2007) Эффективность висмутсодержащей четверной терапии в качестве варианта лечения первой линии для Helicobacter pylori. J Dig Dis 8: 211–215.

    Журнал детской гастроэнтерологии и питания

    Ежегодное собрание Североамериканского общества детской гастроэнтерологии и питания; Торонто, 30 октября — 2 ноября 1997 г.

    97

    Hammond, P D; Штутценбергер, Ф; Батлер, Р. Н.; Читать, L C; Davidson, G P

    Информация об авторе

    Детский научно-исследовательский институт и гастроэнтерологическое отделение, Женская и детская больница, Аделаида, Южная Австралия.

    Неинвазивный метод оценки инфекционного статуса Helicobacter pylori (H. pylori) на мышиной модели будет иметь большое значение. Был разработан быстрый и недорогой протокол проверки дыхания с использованием модифицированного одноразового шприца на 50 мл в качестве камеры для сбора дыхания. Дыхательный тест с С-мочевиной 13 был адаптирован к модели мышей Sydney Strain 1 H. pylori . Влияние перорального приема на результаты дыхательного теста оценивали in vitro и in vivo .Было обнаружено, что и диета, и копрофагия вносят значительный вклад в обнаруженную активность уреазы. Мы обнаружили, что минимальное время, необходимое для ограничения кормления и копрофагии, составило 13 часов. Оптимальная доза 13 C-мочевины составляла 50 микрограммов, которую мы растворяли в 0,1 мл воды и вводили через зонд через желудочно-кишечный тракт после взятия исходного дыхательного образца. Было обнаружено, что оптимальное время для сбора другой пробы дыхания составляет 8 минут. Модифицированный одноразовый шприц на 50 мл обеспечил простую, надежную и экономичную камеру для сбора выдыхаемого воздуха.Средние результаты дыхательного теста для группы из инфицированных H. pylori мышей были выше, чем средние результаты для контрольных мышей. Для использования на отдельных мышах мы обнаружили, что дыхательный тест имеет чувствительность 89% и специфичность 52%. Была показана обратная зависимость между значениями дыхательного теста у контрольных мышей и временным интервалом между тестами, что привело к трудностям в наших попытках проследить установление инфекции H. pylori с частым тестированием. Это первый отчет об адаптации дыхательного теста 13 С-мочевиной к модели мыши H.pylori инфекция. И тип корма, и копрофагия являются критическими детерминантами активности уреазы желудка in vivo и должны контролироваться для проверки дыхания с мочевиной 13 C на этой мышиной модели, чтобы быть действительным.

    Описание раздела

    Posted in Разное

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

    Copyright © 2022 Муниципальное образование «Новоторъяльский муниципальный район» Республика Марий Эл