Сколько у человека длина кишки у человека: Рекомендации по питанию для людей с синдромом короткого кишечника

Содержание

Наука: Наука и техника: Lenta.ru

В кишечнике охотников-собирателей и других ведущих традиционный образ жизни народов гораздо больше микробов, чем у жителей промышленно развитых обществ — зато благодаря этим микроорганизмам «примитивные» народы меньше страдают от заболеваний кишечника: колита, рака толстой кишки, болезни Крона. К такому выводу пришли авторы первого в истории науки анализа кишечной микрофлоры у современных охотников-собирателей, опубликовавшие свое исследование в журнале Nature Communications.

Сесил Льюис (Cecil Lewis) из Университета штата Оклахомы в Нормане отправился к верховьям Амазонки, к племени мацес — одним из последних охотников-собирателей в мире, которые до сих пор питаются мясом обезьян, ленивцев и аллигаторов, а также ловят рыбу и собирают коренья в джунглях. Льюис прочел мацес экспресс-курс биологии, показал кишечные бактерии под микроскопом, и взял у них кал на анализ.

Для сравнения ученый также собрал биоматериал у племени тунапуко — земледельцев Андского высокогорья, выращивающих картофель, а также употребляющих в пищу мясо морских свинок, свинину и баранину. Наконец, анализ кала взяли и у 23 жителей Нормана: работников университета, чья диета характерна для высокоразвитых обществ (мясо, молоко и молочные продукты, полуфабрикаты, консервы).

В своей лаборатории Льюис провел генетический анализ микробиома кишечника. Выяснилось, что у охотников-собирателей и крестьян видовое разнообразие микробов значительно выше, чем у ученых из Нормана. Особенно внимание Льюиса привлекли различные штаммы трепонемы (бактерий-спирохет). Некоторые трепонемы вызывают сифилис и другие болезни, однако штаммы из кишечника мацес и тунапуко оказались ближе к безвредным трепонемам, которые живут в организме других животных (свиней прежде всего).

Трепонемы уже находили в кишечнике хадза — известных охотников-собирателей Танзании, а также различных обезьян. По мнению ученых, трепонемы были важным элементом древнего микробиома человечества, но у современных обитателей индустриального и постиндустриального мира исчезли. Судя по тому, что у свиней трепонемы способствуют перевариванию углеводов, в организме человека они также играли важную роль.

По мнению ученых, утрата трепонем и других кишечных микробов может быть одним из факторов, способствующих аутоиммунным заболеваниям (в том числе колита и болезни Крона). Так что даже переход на «диету первобытного человека» не поможет — ведь у жителей городов утрачены древние кишечные бактерии, работавшие с такой диетой, утверждает Льюис.

Здоровая микрофлора кишечника как защита от болезни Альцгеймера

Если спросить: какой самый важный орган в нашем организме, то многие назовут сердце или мозг. Любители застолий укажут на печень или желудок. Но готовы спорить на что угодно, никто не назовет кишечник. А ведь он защищает нас от болезней, греет, снабжает витаминами и энергией и даже, как выяснили ученые, здоровая микрофлора кишечника может отсрочить наступление рассеянного склероза, бороться с болезнью Альцгеймера и снимать симптомы аутизма… Итак, приведем несколько доказанных фактов о кишечнике.

ФАКТ ПЕРВЫЙ. В кишечнике живет больше микроорганизмов, чем клеток у человека.
В кишечнике проживает невероятное количество микроорганизмов — около 39 триллионов. Это примерно в 1,3 раза больше, чем количество клеток в организме. Большая часть флоры кишечника — это бактерии 300-500 видов. Большая доля нормальной микрофлоры — это полезные анаэробные бактерии: бифидобактерии, пропионовокислые бактерии, бактероиды и лактобактерии. В желудке их мало, в тонком кишечнике чуть больше, а основная часть облюбовала толстый кишечник.
ФАКТ ВТОРОЙ. Кишечник защищает нас от болезней.
Около 80% всех клеток, которые формируют иммунитет организма, находятся в слизистой оболочке кишечника. Они не дают бактериям проникать в нашу кровь, а при столкновении с опасностью активно вырабатывают иммуноглобулин А (IgA) — белок, который обеспечивает иммунитет.
Для повышения иммунитета полезно есть клетчатку — переваривая пищевые волокна, бактерии образуют короткоцепочечные жирные кислоты, такие как ацетат, пропионат и бутират, которые улучшают защитную функцию слизистой кишечника.
ФАКТ ТРЕТИЙ. Подавляет канцерогены, способные вызвать рак.
При тепловой обработке в красном мясе образуются азотсодержащие вещества, являющиеся канцерогенами, а в колбасу для красивого розового цвета добавляют нитрит натрия или нитрит калия, которые при переваривании образуют канцерогенные нитрозамины. Но кишечник обладает защитой от опасности — микрофлора и ферменты его слизистой оболочки способны инактивировать канцерогены. В этом им помогают клетчатка и витамины А, С и Е.
ФАКТ ЧЕТВЕРТЫЙ. Вырабатывает антибиотикоподобные вещества.
Бактерии кишечника производят антимикробные вещества, которые не дают размножаться микробам — возбудителям болезней. Бифидобактерии, лактобактерии и прочие «друзья» человека производят перекись водорода, молочную, уксусную и другие кислоты, способные разрушить, к примеру, бактерии дизентерии и многое другое. Вот почему при расстройстве кишечника у нас падает и общий иммунитет.

ФАКТ ПЯТЫЙ. Площадь поверхности тонкого кишечника – с теннисный корт.
Длина тонкой кишки составляет около 7 метров, а ширина — примерно 2,5 см в диаметре. Весь он покрыт складками и микроворсинками и за счет этого всасывает максимально возможное количество полезных веществ. Если расправить его стенки, они покроют площадь в 250 кв. метров — это размер теннисного корта.
ФАКТ ШЕСТОЙ. Кишечник нас греет.
Микрофлора питается непереваренными в тонком кишечнике остатками пищи — пищевыми волокнами. В результате вырабатывается огромное количество тепловой энергии, которая вместе с кровью разносится по организму. Вот почему человек всегда мерзнет, если голодает.
ФАКТ СЕДЬМОЙ. Синтезирует фолиевую кислоту и другие витамины.
Некоторые важные витамины вырабатываются в кишечнике, а не поступают готовые с пищей.
Это:
К2 — необходим для нормального свертывания крови.
В12 — отвечает за обмен веществ и помогает в работе нервной системы.
В3 — положительно влияет на работу сердечно-сосудистой системы, регулирует давление, очищает от токсинов.
В9, фолиевая кислота — участвует в кроветворении, укрепляет защитные функции, важна для беременных женщин, так как помогает формировать нервную систему ребенка.
Кроме того, в кишечнике синтезируются другие важные витамины группы В и аминокислоты.
ФАКТ ВОСЬМОЙ. Микрофлора кишечника производит «гормон счастья».
Микрофлора кишечника может влиять на наше настроение и память, и поэтому ей дали имя «второй мозг». Эта связь называется «ось кишечник-мозг» и сейчас активно изучается. Ученые уже сделали выводы, что здоровая микрофлора может отсрочить наступление рассеянного склероза, бороться с болезнью Альцгеймера и снимать симптомы аутизма. Скажем больше, исследователи утверждают, что микрофлора способна производить «гормон счастья» и если она чувствует себя хорошо, то и у нас вырастают крылья за спиной.
Все это имеет, к сожалению, и обратный эффект: если кишечник не в порядке, качество жизни падает. Витамины всасываются хуже, кожа выглядит серой, цепляется простуда, настроение на нуле. Причины, нарушающие благоденствие микрофлоры, — это недостаток клетчатки, прием антибиотиков, отсутствие движения, стрессы, переутомление и другие частые спутники современного горожанина.
Если нарушения питания и стрессы случаются не раз-два, а являются нормой жизни, то возможны разные расстройства, среди которых такое явление, как раздраженный кишечник. От него страдает каждый пятый человек в мире. Боль или спазм в животе плюс вздутие, запор или диарея — обычные признаки раздраженного кишечника.
Так что относитесь к этому важному органу с заботой и уважением и ждите, когда он отплатит порцией «гормона счастья».
#нацпроектдемография89

Толстяка нужно заставить есть поменьше — даже если для этого потребуется операция

Хирургия ожирения — по меркам медицины, одной из древнейших наук, — направление молодое. Помимо липосакции, не устраняющей саму причину ожирения, сейчас бурно развивается бириатрическая хирургия, перекраивающая весь пищеварительный тракт. Что заставляет человека решиться на такой шаг, что с ним делают на операционном столе и какова эффективность метода, — на все эти вопросы дает ответы опыт российской бариатрии, признанной и уважаемой во всем мире.

Новое пополнение

«Лет десять назад человек весом 200 или 240 кг в нашем отделении казался нонсенсом. Сейчас привыкли, — говорит терапевт Клиники лечебного питания НИИ питания Камилат Гаппарова. — Пациентов с морбидным ожирением становится с каждым годом все больше.» Морбидное — значит болезненное, во всех значениях этого слова: и в смысле субъективных ощущений полного человека, и объективной картины состояния его здоровья.

По словам доктора Гаппаровой, из 35 пациентов в ее отделении сейчас обычно 5 — 6 с массой тела свыше 150 кг, раньше было 1 — 2. «Мы даже не ставим перед ними задачу похудеть до нормального веса. Хорошо, если их вес снизится до уровня, позволяющего вести обычную жизнь, а параметры крови придут к норме», — признается Камилат Гаппарова.

По ее словам, эффективного метода лечения ожирения нет, как не было никогда. Но чем больше вес пациента, тем сильнее, по ее наблюдениям, у него ожидание чуда: чудодейственной таблетки, волшебной диеты, чего угодно, от чего можно похудеть быстро и намного.

Камилат Гаппарова — терапевт, как подавляющее большинство докторов в мире, лечащих от ожирения. Но некотрых своих пациентов она направляет к коллегам — бариатрическим хирургам. Тех, у кого анализы вот-вот покажут значения, несовместимые с жизнью, и нет надежды, что человек самостоятельно справится со своим аппетитом. Кто-то идет к хирургам сам, отчаявшись получить помощь от других врачей. «Мы всегда предупреждаем: «Вы идете на серьезную операцию и моментального результата она не даст». Но так уж мы, люди, устроены, хотим все сразу, здесь и сейчас», — говорит доктор Гаппарова.

Сделано в России

«В России около сотни бариатрических хирургов делают порядка двух тысяч операций в год. Примерно восемьсот из них делаем мы», — доктор Владимир Евдошенко, вице-президент Российского общества бариатрических хирургов, гордится родным коллективом Клинического центра хирургии лишнего веса и метаболических нарушений, в котором вместе с профессором Вадимом Феденко занимает ведущие позиции. Весной 2016 года в Москве состоится Европейский конгресс Международной федерации хирургии ожирения и метаболических нарушений (IFSO). Президентом Европейской федерации IFSO на очередной срок 2012 — 2014 гг. избран профессор Юрий Яшков, что лишний раз подтверждает признание высокого профессионального уровня отечественной бариатрии. Две тысячи пациентов в год в масштабах страны не много. Но и не мало, ведь это не очередная модная диета, а серьезная мера: люди ложатся на операционный стол, позволяя хирургам изменять анатомию и физиологию пищеварительного тракта. Что с ними делают?

Тонкая и короткая

«История развития бариатрической хирургии насчитывает более 60 лет, за это время были предложены, опробованы и отвергнуты десятки различных операций. Но теоретическая основа бариатрии простая», — рассказывает Владимир Евдошенко. Если человек не в силах справиться с постоянным накоплением жира, надо сделать так, чтобы жир перестал накапливаться по объективным причинам. Для этого требуется ограничить поступление питательных веществ из пищи человека в его кровь. Где они всасываются в кровь? В тонком кишечнике и только там. В толстом кишечнике всасываются только вода и витамины. Значит, надо укоротить тонкий кишечник. Его длина 7 — 8 метров. Но если начальный отрезок тонкой кишки соединить сразу с конечным, то пища пойдет по короткому пути длиной примерно в полметра (рис. 1).Большая часть тонкого кишечника остается заглушенной, пища туда не попадает. В 1960-е годы тонкокишечное шунтирование стало одной из первых схем бариатрической пластики. Эффект операции был потрясающим. Человек худел очень сильно, вес снижался даже ниже нормального. Но довольно быстро выяснилось, что в заглушенном участке тонкой кишки развивалась гнилостная микрофлора, которая постепенно отравляла организм.

Истребление гнили

Ситуацию исправил итальянский доктор Никола Скопинаро, один из старейших и заслуженных бариатрических хирургов, почетный президент IFSO. Его операция называется билиопанкреатическим шунтированием. Петлю тонкой кишки, куда впадают протоки желчи от печени и сока поджелудочной железы, способствующие всасыванию пищи, он отвел в конечный отдел тонкого кишечника (рис. 2). Пищеварительный процесс и всасывание питательных веществ в кровь опять происходили на ограниченном участке тонкого кишечника, как при обычном его шунтировании. Только полностью отключенной от пищеварения петли тонкой кишки не было, и, соответственно, вроде бы не должно было быть вредных последствий. К сожалению, последствия все-таки были, только проявлялись они позже, чем при обычном шунтировании. Нарушался обмен веществ. Такова, увы, поначалу была цена операций, получивших название мальабсорбционных, то есть ограничивающих в кишечнике зону всасывания питательных веществ.

Рукав вместо мешка

Другой путь — ограничить приход калорий, если не получается увеличить их расход до отрицательного или хотя бы нулевого баланса, — был тоже очевиден. Надо просто уменьшить объем желудка человека, чтобы он меньше ел. Первое, что приходит на ум, просто ушить желудок, отрезав от него часть. Так и делают, операция называется рукавной гастропластикой (рис. 3). Она зарекомендовала себя как эффективный способ снижения веса и стала мировым стандартом. «При этой операции не только ограничивается объем желудка, но и формируется узкая желудочная трубка, которая вызывает стойкое чувство насыщения, — поясняет Владимир Евдошенко. — В настоящее время рукавная гастропластика занимает уже больше половины всей хирургической активности в области бариатрии. Относительным недостатком можно считать ее необратимость. При всех остальных бариатрических операциях желудочно-кишечный тракт можно вернуть в исходное состояние, если возникнет такая необходимость или желание.»

Желудок в форме песочных часов

Оригинальный, если не сказать остроумный способ — бандажирование желудка (рис. 4). Чувство сытости приходит к человеку не просто, когда он наполняет желудок пищей, а когда пища начинает растягивать верхнюю часть желудка, где расположены рецепторы насыщения. Так устроено природой, чтобы человек не остался голодным. Только когда желудок полон под завязку, рецепторы близ этой завязки сигнализируют в мозг: пора остановиться. На верхнюю часть желудка, чуть ниже зоны рецепторов насыщения, накладывается бандаж в виде пластикового кольца с регулируемым сжатием. Получаются как бы два желудка. Верхний маленький, объемом всего 10 — 15 мл. Достаточно съесть одну ложку, и от рецепторов идет сигнал: достаточно, я сыт. «Этот способ, к сожалению, — не окончательное решение проблемы. Время пребывания импланта в теле пациента ограничено, — предупреждает доктор Евдошенко. — В среднем силиконовый бандаж удерживается в организме в течение 5 — 7 лет.Затем его приходится удалять и делать какую-нибудь более радикальную бариатрическую операцию».

Title2>Резекция диабета

Желудочное шунтирование (рис. 5) сочетает в себе оба главных принципа бариатрии: уменьшение объема желудка и зоны всасывания питательных веществв тонком кишечнике. Путем пересечения желудка в верхней части создается «малый желудочек» объемом около 30 — 50 мл, а к нему подшивается тонкая кишка примерно посередине своей длины. По наблюдениям профессора Евдошенко, этот способ обладает совершенно потрясающим влиянием на сахарный диабет второго типа. «Даже в запущенных случаях диабет после желудочного шунтирования проходит совсем или приобретает доброкачественное течение», — говорит он. «В мире примерно 40 процентов операций приходится на желудочное шунтирование, 50 процентов на рукавную пластику и 10 процентов — на остальные», — говорит профессор Вадим Феденко. Все операции проводят щадящим методом лапароскопии.»

Без большой крови

Популярность бариатрические операции получили только после того, как появилась лапароскопия — хирургия внутренних органов без больших разрезов. В небольшие отверстия в стенке брюшины внутрь вводят тонкие инструменты, а изображение выводится на монитор. Вскрытие брюшной полости по старинке скальпелем не подходит пациентам с избыточным весом, порой весьма большим. Помимо серьезной кровопотери, неизбежной при таких операциях, заживление большого разреза у них идет долго, чревато нагноениями, а лежать неподвижно несколько суток при их весе опасно: быстро образуются пролежни и застойные явления в легких

Эффективность хирургии ожирения

По словам доктора Вадима Феденко, наибольшим авторитетом у специалистов пользуется шведская статистика Swedish Obese Subjects (SOS) за ее полноту и продолжительность срока наблюдений. Согласно SOS, жизнь пациентов после бариатрических операций увеличивается в среднем на 10 лет по сравнению с контрольными группами. Впрочем, любой может заглянуть в эту статистику сам. Там нет каких-то рекордов, обычная норма потерь веса от 20 % до 30 %. Но для человека весом 120 или 140 кг, устойчиво похудеть на 25 или 40 кг — словно заново родиться. Понятно, что полостная операция остается операцией даже при лапароскопии. Последствия модифицированного желудочно-кишечного тракта дают себя знать, особенно в первое время. Но и когда операционные шрамы разгладятся, придется изменить некоторые привычки, иногда до конца жизни принимать лекарства и колоть витамины.

Есть ли третий способ вылечить ожирение, кроме терапевтического (диеты, лекарства, физиотерапия) и хирургического (липосакция и бариатрия)? Пока нет, но наверняка появится. Он будет генетическим, точнее геномодифицирующим (см. Упитанность как генетическая норма). Исчезнет ли после этого проблема болезненного ожирения? Вряд ли. Ставка только на медицину отдает ветеринарией, как метко замечают психологи (см. Почему трудно худеть в одиночку). Так что, похоже с лишним весом нам придется жить всегда.

1 Пищевод

2 Желудок

3 Желчный пузырь

4 12-перстная кишка

5 Желчные протоки

6 Тонкая кишка

7 Толстая кишка

8 Заглушенный конец тонкой кишки

9 «Общий канал» тонкой кишки длиной 50 см

10 Общий печеночный проток

11 Резецированный желудок

12 Билиопанкреатический лимб

13 Тощеподвздошный анастомоз

14 Слепая кишка

15 Прямая кишка

16 Панкреатический проток

17 Гастроэнтероанастомоз

18 Зона расположения рецепторов насыщения в желудке

19 «Малый желудочек» над кольцом

20 Регулируемое ограничительное кольцо

21 «Большой желудок» под кольцом

22 «Малый желудочек» объемом 30 мл

23 «Заглушенный» конец тонкой кишки, соединенный с «малым желудочком»

текст Сергей Петухов, кандидат биологических наук

иллюстрации Люба Березина

маргиналии Тимофей Яржомбек

Анатомическое исследование длины кишечника человека

Рак остается ведущей причиной смерти после сердечно-сосудистых заболеваний во всем мире и, по оценкам, в 2012 г. от него умерло 8,2 млн человек. К 2030 г. ожидается 13 млн смертей от рака из-за роста и старения населения. Таким образом, колоректальный рак (КРР) является третьим наиболее распространенным видом рака у мужчин и вторым у женщин с широкими географическими вариациями по всему миру. Обычно CRC начинается как доброкачественный рост, ведущий к аденоматозному полипу или аденоме, возникающей из железистых клеток.Поскольку исследования позволили лучше понять механизмы развития рака, в последние десятилетия появились новые методы лечения, такие как таргетная терапия. Несмотря на это, до 95% противоопухолевых препаратов, протестированных в ходе клинических испытаний I фазы, не получают одобрения на рынке, и, следовательно, эти высокие показатели отсева остаются ключевой проблемой для фармацевтической промышленности, делая процессы разработки лекарств чрезвычайно дорогостоящими и неэффективными. Таким образом, срочно необходимы новые доклинические модели in vitro, которые могут более точно прогнозировать реакцию на лекарственные препараты in vivo.Тканевая инженерия не только дает возможность создавать искусственные трехмерные (3D) ткани in vitro, такие как функциональные органы, но также позволяет исследовать реакцию на лекарства в моделях патологических тканей, то есть в трехмерных моделях рака, которые превосходят обычные двумерные (2D) клеточные культуры в чашках Петри и могут преодолеть ограничения животных моделей, тем самым уменьшая потребность в доклинических моделях in vivo. В этой диссертации были созданы новые 3D-модели CRC на основе децеллюляризованного кишечного матрикса.В первой части можно было показать, что клеточная линия SW480 демонстрировала характеристики, отличающиеся при выращивании в 3D-среде от таковых в обычной 2D-культуре. В то время как клетки демонстрировали мезенхимальный фенотип в 2D-культуре, они демонстрировали более выраженный эпителиальный характер в 3D-модели. Добавляя стромальные клетки (фибробласты), раковые клетки изменили свой характер роста и построили опухолеподобные структуры вместе с фибробластами, тем самым ремоделируя естественные структуры слизистой оболочки.Кроме того, созданную 3D-модель опухоли использовали в качестве тест-системы для лечения стандартным химиотерапевтическим 5-фторурацилом (5-ФУ). Вторая часть диссертации была посвящена созданию трехмерной тест-системы in vitro для таргетной терапии. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США уже одобрило ряд препаратов для таргетной терапии определенных видов рака. Например, малая молекула вемурафениба (PLX4032, Zelboraf™), которая продемонстрировала впечатляющую частоту ответа в 50–80% у пациентов с меланомой с мутацией киназы быстроускоряющегося онкогена фибросаркомы типа B (BRAF), которая относится к митоген-активной протеинкиназе. МАРК) сигнальный путь.Однако только 5% пациентов с КРР, несущих ту же мутацию BRAF, реагируют на лечение вемурафенибом. Объяснением этой невосприимчивости может быть обратная активация восходящего EGFR, реактивация пути MAPK, который поддерживает пролиферативную передачу сигналов. Для проверки этой гипотезы использовали две клеточные линии раннего пассажа HROC24 и HROC87, обе из которых несут мутацию BRAF V600E, но отличаются другими мутациями, и их лекарственный ответ на вемурафениб и/или гефитиниб оценивали в обычной 2D-культуре клеток и сравнивали с более продвинутая 3D-модель.В условиях 3D-культивирования обе клеточные линии показали снижение скорости пролиферации только при комбинированном подходе к терапии. Кроме того, не было обнаружено существенных различий между различными подходами к лечению и необработанным контролем в отношении скорости апоптоза и жизнеспособности обеих клеточных линий в трехмерной модели опухоли, которая придавала раковым клеткам повышенную химиорезистентность. Из-за наблюдаемой невосприимчивости к ингибированию BRAF вемурафенибом, что можно наблюдать в клинике у пациентов с мутациями BRAF при CRC, клеточную линию HROC87 использовали для дальнейших экспериментов по ксенотрансплантации и анализа активационных изменений в сигнальном пути MAPK.Можно было показать, что клетки продемонстрировали реактивацию Akt в 3D-модели при обработке обоими ингибиторами, что свидетельствует об ускользающем механизме апоптоза, которого не было в клетках, культивируемых в обычных 2D-условиях. Кроме того, в клетках наблюдалась активация рецептора фактора роста гепатоцитов (HGFR, c-Met) в 2D- и 3D-культуре, но это не было обнаружено в модели ксенотрансплантата. Это показывает ограничения моделей in vivo. Результаты предполагают другую петлю активации с обратной связью, чем EGFR, которая, возможно, в первую очередь не участвует в механизме резистентности.Это отражает ранее упомянутые высокие показатели отсева в доклинических испытаниях лекарств.

Всасывание аминокислот в толстом кишечнике людей и моделей свиней | Журнал питания

Аннотация

Международные органы власти признали качество пищевого белка критически важным, поскольку оно может влиять на важные функции организма. Для прогнозирования качества белка ФАО ввела показатель усваиваемости незаменимых аминокислот.Эта оценка зависит от усвояемости аминокислот (АК) в подвздошной кишке; поэтому делается предположение, что аминокислоты не всасываются в количествах, соответствующих питательным веществам, из толстого кишечника. В этой статье рассматриваются доказательства этого предположения путем рассмотрения роли толстой кишки млекопитающих в переваривании и всасывании пищевого белка и аминокислот с особым упором на взрослых людей. Хотя большая часть диетических аминокислот и пептидов всасывается в тонком кишечнике, их значительное количество может попасть в толстый кишечник.Азот всасывается в толстом кишечнике, и ряд экспериментов на животных указывает на потенциальную небольшую степень всасывания АК. У человека колоноциты обладают способностью абсорбировать АК, поскольку в толстой кишке присутствуют переносчики АК. Однако всасывание необходимых для питания количеств незаменимых аминокислот и пептидов в толстой кишке человека не было убедительно продемонстрировано.

Введение

Международные органы, такие как ФАО и ВОЗ, признали качество пищевого белка критическим вопросом.Качество белка может влиять на важные функции организма и действительно влияет на иммунную систему и рост; это особенно важно для некоторых специфических групп населения, таких как дети, у которых качество белка играет важную роль в поддержании их роста (1), и у пожилых людей, у которых качество белка является важным фактором в предотвращении саркопении (2).

Пищевая ценность различных пищевых источников белка зависит как от состава аминокислот (АК), так и от биодоступности АК (т.е., способность белка обеспечивать адекватный профиль биодоступных незаменимых аминокислот с пищей). В большинстве случаев эта биодоступность определяется главным образом процессами переваривания и всасывания в желудочно-кишечном тракте. Подвздошная переваримость АК с пищей определяется как разница между потреблением АК с пищей и конечным поступлением АК из подвздошной кишки в толстую кишку. Поправка на «эндогенный» поток АА в подвздошной кишке, который включает эндогенные выделения из слизи и ферментов, сброшенные эпителиальные клетки и микробную биомассу, дает показатели «истинной» (или стандартизированной) усвояемости.Определение переваримости на уровне подвздошной кишки требует сбора илеального дигеста.

Альтернативный традиционный подход к получению значений усвояемости АК заключается в определении потери АК во всем пищеварительном тракте путем отбора проб содержимого фекалий. Этот подход использовался для определения индекса аминокислот с поправкой на усвояемость белка (PD-CAAS), введенного ФАО и ВОЗ (3). PD-CAAS определяет усвояемость сырого протеина в фекалиях у растущей крысы и был предназначен для прогнозирования качества белка с точки зрения потенциальной способности пищевого белка обеспечивать соответствующую структуру незаменимых аминокислот с пищей для удовлетворения потребности в незаменимых аминокислотах при концентрации средняя потребность в белке (0.66 г ⋅ кг −1 ⋅ d −1 у взрослых людей). Однако было выявлено несколько ограничений подхода PD-CAAS (4, 5), что привело к введению индекса усваиваемости незаменимых аминокислот (DIAAS) (6). DIAAS рассматривает перевариваемую подвздошной кишкой незаменимую аминокислоту в пищевом белке по сравнению с эталонной потребностью человека в аминокислоте. Одним из ограничений подхода PD-CAAS является то, что поправка на усвояемость основана на оценке усвояемости сырого протеина, определенной во всем пищеварительном тракте (т.д., усвояемость сырого протеина с фекалиями). Определение переваримости АК в терминальном отделе подвздошной кишки, которое используется для определения ДИААС, обычно считается более точным, чем традиционный фекальный метод, поскольку значения переваримости фекалий обычно завышены в результате микробного метаболизма белков, пептидов и АК (7). ). Недостатки анализа экскрементов всего тракта подчеркиваются наблюдением у видов с однокамерным желудком, что белок экскрементов представляет собой преимущественно микробный белок (8, 9), а это означает, что лишь небольшая часть потока АК в конце пищеварительного тракта напрямую связана с к потоку непереваренных аминокислот, поступающих в заднюю кишку.В этом контексте неудивительно, что были обнаружены низкие статистические корреляции между показателями роста и фекалиями усвояемости белка у свиней (10, 11). Усвояемость подвздошной кишки точно предсказывает всасывание АК, как показано на свиньях (12–14). Кроме того, анализ чувствителен к обнаружению небольших изменений в усвояемости АК из-за таких эффектов, как переработка корма (15, 16). Исследование Rutherfurd et al. (14) информативна тем, что отложение лизина в теле свиньи измеряли непосредственно при тщательно контролируемом рационе.Было показано, что истинная усвояемость лизина подвздошной кишки является точным индикатором поглощения лизина организмом (14).

Подвздошный метод, хотя он явно превосходит метод фекальной перевариваемости (4, 17), основан на предположении, что АК не всасываются в количествах, необходимых для питания, из толстой кишки. Это допущение имеет решающее значение, поскольку оно узаконивает использование переваримости АК в подвздошной кишке в качестве основы для оценки качества белка в соответствии с DIAAS. Таким образом, мы стремились проанализировать доказательства предположения о том, что аминокислоты не всасываются в соответствующих с точки зрения питания количествах из толстой кишки взрослых людей, принимая во внимание роль толстой кишки в переваривании и всасывании диетического белка, а также аминокислот.

Переваривание и всасывание белков в тонком кишечнике

Пищевые белки после приема внутрь расщепляются и всасываются в желудочно-кишечном тракте. Ферменты, выделяемые желудком (пепсины) и поджелудочной железой (панкреатические протеазы), гидролизуют пептидные связи в белках, что приводит к образованию олигопептидов (18, 19). Последующий гидролиз происходит на апикальной (щеточной) мембране кишечной стенки, где пептидазы далее расщепляют олигопептиды до ди- и трипептидов и свободных аминокислот, которые транспортируются в энтероцит.После некоторого дополнительного внутриклеточного переваривания и метаболизма АК транспортируются через базолатеральную мембрану и попадают в портальную циркуляцию и становятся доступными для метаболизма (18). Существует мало однозначных доказательств того, что диетические пептиды, кроме ди- и трипептидов в относительно небольших количествах, могут проникать через стенку кишечника и попадать в портальное кровообращение (20). Абсорбция АА (как таковая) считается завершенной в конце терминального отдела подвздошной кишки.

Хотя переваривание белков в верхних отделах пищеварительного тракта происходит относительно эффективно, в толстую кишку все же попадают значительные количества белков и пептидов, некоторых аминокислот и других азотсодержащих метаболитов.Количество белка или азота, поступающего в толстую кишку, сильно зависит от типа и количества потребляемого белка, диетических антипитательных факторов и пищевых волокон (21, 22). Чако и Каммингс (23) показали у 6 илеостоматозов, что потеря азота из подвздошной кишки составила 0,9 г/сутки на диете с низким содержанием азота (0,17 г N/сутки), увеличиваясь до 2,2 г/сутки на диете с низким содержанием азота. диета + диета из цельных соевых бобов (5,87 г N/день, из которых ∼50% приходится на белок). Когда соевые бобы были очищены, потери азота в подвздошной кишке сократились до 1.42 г/сут, в то время как диета с высоким содержанием клетчатки (10,7 г N/сут) привела к сопоставимой потере азота подвздошной кишкой 2,2 г/сут. Таким образом, физическая форма пищи влияла на потерю азота подвздошной кишкой, в то время как клетчатка, по-видимому, не оказывала существенного влияния (23). Менее 10–15% общего азота приходилось на мочевину, аммиак или свободные аминокислоты, 48–51% — на белок, а остальные 20–30% — на пептиды (23). Эти азотсодержащие соединения имеют различное происхождение. Они могут быть эндогенного происхождения, в основном муцин, пищеварительные ферменты, клетки слизистой оболочки и микробные пептиды (последние непищевые, но не строго эндогенные), или диетического происхождения (24, 25).По оценкам, количество пищевого азота, поступающего в толстую кишку, составляет от 25% до 54% ​​от общего количества азота, выводимого из терминального отдела подвздошной кишки у свиней (24). Если предположить, что 0,9–2 г азота поступает в толстую кишку, из которых 25–54% приходится на продукты питания, то в толстую кишку в сутки поступает примерно 0,25–1 г пищевого азота. Принимая во внимание регулярное ежедневное потребление белка человеком в размере 90 г/сутки [среднее потребление в Европе (26)], что равно 14,4 г потребления азота, эти уровни поступающего с пищей азота в толстую кишку имеют значение.Количество азота, поступающего в толстую кишку, может быть значительно выше для более плохо перевариваемых источников белка.

Микробная аминокислота и синтез белка

Кишечные микробы как в тонком, так и в толстом кишечнике могут синтезировать аминокислоты и белки. Для микробного синтеза белка в кишечнике доступны несколько источников азота, а именно аммиак, мочевина, пищевые АК и пептиды, эндогенные АК и пептиды, а также другие азотсодержащие вещества (включая глутатион, полиамины, пурины, пиримидины, нитриты, нитраты, мочевую кислоту, и нитрозилированные продукты) (22).Однако синтез АК de novo в тонкой кишке может не вносить большого вклада в поступление АК. Либао-Меркадо и др. (27) оценили относительный вклад мочевины, эндогенного белка и пищевого белка в микробный валин в конце подвздошной кишки растущих свиней. Более 92% микробного валина в подвздошной кишке, по-видимому, происходит из пищевых и эндогенных белков (предварительно сформированный валин), а не синтезируется de novo.

АК, синтезированные кишечными микробами, могут всасываться, поскольку они появляются в пуле свободной АК плазмы.Для лизина, АК, который не подвергается трансаминированию, считается, что 2–20% общего лизина в организме получают из кишечных микробных источников (как тонкого, так и толстого кишечника) у моногастричных животных, включая взрослых людей (28, 29). Кроме того, для лейцина вклад синтеза кишечной микробиоты в общее потребление организма оценивается в 20% (30). Микробное содержание тонкой кишки низкое по сравнению со слепой кишкой и толстой кишкой, но бактерии тонкой кишки обладают высокой метаболической активностью.Обогащение микробным белком в толстой кишке было обнаружено после приема внутрь 15 NH 4 Cl у свиней (31, 32) и людей (33, 34). Однако в элегантном эксперименте на свиньях было подсчитано, что 93% микробно синтезированного лизина всасывается в тонком кишечнике, а не в толстом кишечнике (31). Несмотря на высокую микробную популяцию в толстой кишке, абсорбция микробно-синтезированного лизина в толстой кишке была низкой. Аналогичные данные для человека отсутствуют.

Переваривание и всасывание белков в толстой кишке

В соответствии с количеством белка и азота, поступающих в толстую кишку, метаболизм АК в толстой кишке играет важную роль в белковом обмене всего организма (рис. 1). Одним из основных игроков является микробиота толстого кишечника, которая способна не только переваривать и ферментировать белки и АК, но также способна синтезировать АК de novo (28). Кроме того, колоноциты толстого кишечника могут метаболизировать и синтезировать АК, хотя эти АК, вероятно, образуются из кровообращения.Азот всасывается в толстой кишке, и, возможно, там же всасываются люминальные АК.

РИСУНОК 1

Метаболизм пептидов и АК в толстом кишечнике. Белки, пептиды, некоторые аминокислоты и другие соединения азота попадают в толстую кишку. Кишечная микробиота способна переваривать и ферментировать белки и аминокислоты, а также синтезировать аминокислоты de novo. Колоноциты толстой кишки могут метаболизировать и синтезировать АК, хотя эти АК, вероятно, образуются из кровообращения.Азот всасывается в толстой кишке и активно рециркулируется непосредственно и через пищеварительный тракт. Вопрос о том, всасываются ли АК в толстой кишке человека, до сих пор остается предметом дискуссий. АА, аминокислота.

РИСУНОК 1

Метаболизм пептидов и АК в толстой кишке. Белки, пептиды, некоторые аминокислоты и другие соединения азота попадают в толстую кишку. Кишечная микробиота способна переваривать и ферментировать белки и аминокислоты, а также синтезировать аминокислоты de novo. Колоноциты толстой кишки могут метаболизировать и синтезировать АК, хотя эти АК, вероятно, образуются из кровообращения.Азот всасывается в толстой кишке и активно рециркулируется непосредственно и через пищеварительный тракт. Вопрос о том, всасываются ли АК в толстой кишке человека, до сих пор остается предметом дискуссий. АА, аминокислота.

Переваривание и ферментация белков в толстой кишке.

Интактные белки, выходящие из тонкого кишечника или образующиеся в толстом кишечнике (слизь, клетки, микробные белки), далее перевариваются в толстом кишечнике бактериальными ферментами и сохранившимися панкреатическими протеазами и пептидазами (35, 36).Сообщалось, что эта деградация белка наиболее высока в дистальном отделе толстой кишки и, скорее всего, связана с рН в различных областях (37). Переваренные белки могут использоваться микробиотой, которая производит несколько метаболитов, таких как SCFAs, аммиак и амины. Эти метаболиты могут быть связаны с несколькими последствиями для здоровья (38).

Всасывание АА в толстом кишечнике.

Хотя почти все отдельные свободные АК присутствуют в проксимальном и дистальном отделах толстой кишки человека на уровнях ниже предела обнаружения, было обнаружено, что общая концентрация свободных АК составляет 3.4 и 6,3 ммоль/кг кишечного содержимого в проксимальном и дистальном отделах толстой кишки соответственно (36). Типичные характеристики содержимого толстой кишки, такие как высокая вязкость и ограниченное смешивание, могут ограничивать воздействие АК на стенку кишечника. Преобладающими доказательствами является то, что млекопитающие с однокамерным желудком (простой желудок), включая человека, не всасывают эти АК в толстой кишке (7, 39, 40). Поддерживает ли обзор доступной литературы это предположение? Всасывание свободных АК из толстой кишки у новорожденных свиней хорошо воспринимается (41, 42).Однако эта способность быстро снижается через несколько дней (43, 44). Несколько исследований продемонстрировали, что введение аминокислот или белка в толстую или слепую кишку пожилых свиней приводит к перевариванию материала и количественному восстановлению введенного азота в виде азота с мочой (45–50). В этих исследованиях наблюдалась тенденция к улучшению азотистого баланса всего тела, и хотя эффект был небольшим, он наблюдался почти во всех исследованиях (51). Из этих исследований трудно сделать вывод, действительно ли АК всасывались в небольших количествах в толстой кишке, потому что некоторое количество небелкового азота могло быть абсорбировано и рециркулировано в тонком кишечнике для синтеза и всасывания АК (48).

Хорошо контролируемый эксперимент был проведен Darragh et al. (52) у молодых свиней, чтобы определить, поглощаются лизин и/или метионин в количествах, соответствующих питательным веществам, из проксимального отдела толстой кишки. В их перекрестном дизайне животных кормили диетой, в которой было либо мало лизина, либо метионина и цистеина, но она была сбалансирована по всем остальным аминокислотам. Солевой раствор или изотонический раствор, содержащий недостающие аминокислоты, вводили в проксимальный отдел толстой кишки через катетер и контролировали экскрецию азота с мочой.Дефицитные диеты привели к более высокой экскреции азота с мочой, которая не улучшилась, когда дефицитные АК были доставлены путем инфузии толстой кишки, что свидетельствует о том, что в толстой кишке не абсорбировалось питательно значимое количество АК. Вюнше и др. (53), используя сравнимый подход с диетами с дефицитом лизина и изолейцина, не отметили улучшения азотистого баланса при введении в слепую кишку дефицитных аминокислот, хотя это имело место при пероральном приеме добавок. В серии экспериментов с использованием 15 N-меченого лизина и 14C-меченого изолейцина, введенных в слепую кишку растущих свиней (54–56), был сделан вывод, что 1–2% введенной АК можно обнаружить в белке организма.Большая часть метки всасывалась в виде небелкового азота и выводилась с мочой. Ниияма и др. (57) провели комбинированный эксперимент in vitro и in vivo, чтобы выяснить, обладают ли свиньи способностью поглощать АК, синтезируемые из азота мочевины местными микробами в толстом кишечнике. После инфузии 15 N-меченых микроорганизмов в слепую кишку был сделан вывод, что 15 N АК, обнаруженные в венозном кровоснабжении толстой кишки, были получены непосредственно из введенных микроорганизмов, предполагая, что свиньи обладают способностью использовать микробные АК синтезировались из азота мочевины в толстой кишке, но это не доказывало всасывания АК.Аналогичное наблюдение было сделано в кишечнике лошади. Постилальное поглощение 15 N-меченых лизина и других незаменимых аминокислот было продемонстрировано после введения 15 N-меченых бактерий в слепую кишку (58). Последние 2 наблюдения подтверждаются обнаружением того, что инфузированные АК исчезли из изолированной слепой кишки свиньи in situ, ограничивая при этом микробиологическую деградацию (59), и демонстрацией в эксперименте in vitro того, что большие толстые кишки свиней и пони способны транспортировать лизин через апикальной эпителиальной мембраны с помощью пузырьков мембраны щеточной каймы (60), но транспорт через базолатеральную мембрану не был продемонстрирован.

Несмотря на то, что растущая свинья является установленной моделью переваривания белков у взрослых людей, необходимы прямые данные исследований на людях. Насколько нам известно, был проведен только один эксперимент, непосредственно оценивающий всасывание АК в толстой кишке человека. В этом эксперименте исследовали 6 детей в возрасте от 1 до 5 месяцев с колостомией. Всем новорожденным была наложена колостома из-за болезни Гиршпрунга или некротизирующего энтероколита. У 2 человек колостома располагалась в середине поперечной ободочной кишки, у одного — в сигмовидной области, у 3 — у печеночного изгиба. 15 N-меченый дрожжевой белок вводили через катетер либо в дистальный, либо в проксимальный отдел толстой кишки. Через 24 часа большая часть метки 15 N в инфузированном дрожжевом белке, меченном 15 N, была абсорбирована и включена в белок организма (61). Невозможно было определить, было ли поглощение интактными аминокислотами или аммиаком, и перенос результатов на взрослых людей затруднен.

Таким образом, серия экспериментов на животных свидетельствует о некоторой степени всасывания, в частности, при введении АК на уровне слепой кишки, части кишечника, которая анатомически отличается у свиней и людей.Только одно исследование на людях у маленьких детей с колостомией дает некоторые доказательства всасывания в толстой кишке. Невозможно сделать вывод, соответствует ли это пищевым пропорциям, в частности, у взрослых людей.

Транспортеры АК в толстой кишке.

Хотя исследования показывают, что некоторая абсорбция АК возможна в толстой кишке, значение белка в организме и баланса АК неясно, особенно для людей. Дополнительную поддержку концепции всасывания АК в толстом кишечнике дает работа по определению границ АК и транспортеров пептидов в кишечнике (62).

АА и ди- и трипептиды транспортируются в основном различными переносчиками растворенных веществ (SLC), которые составляют большое семейство различных специализированных переносчиков. Многие из этих транспортеров экспрессируются в толстой кишке. Здесь мы сосредоточимся на человеческих доказательствах экспрессии транспортеров в толстой кишке. Существуют различные уровни доказательств экспрессии этих транспортеров, например, доказательства на уровне белков или уровне экспрессии генов. SLC15A1 , также известный как переносчик пептидов 1 (PEPT1), является переносчиком ди- и трипептидов, и с помощью иммуногистохимии было показано, что этот белок экспрессируется в дистальном отделе толстой кишки (63).Насколько нам известно, это единственный переносчик, который, как было доказано, экспрессируется на уровне белка в толстой кишке человека. Кроме того, сообщалось об экспрессии генов многих других переносчиков АК в толстой кишке, в основном связанной с их экспрессией в тонкой кишке. Экспрессия SLC7A5 , также известного как переносчик аминокислот L-типа (LAT) 1, SLC7A6 , также известного как LAT3, и SLC5A1 , также известного как транспортер 2, предпочитающий аланин, серин, цистеин (ASCT2) , все из которых способны транспортировать нейтральные АК, были выше в толстой кишке, чем в тонкой кишке (64–66).Кроме того, SLC6A14 , также известный как натрий- и хлорид-зависимый переносчик нейтральных и основных аминокислот B(0+) (ATB0,+), показал более высокую экспрессию в нисходящей ободочной кишке, чем в подвздошной кишке, тогда как SLC36A1 также известный как переносчик AA с помощью протонов 1 (PAT1)] показал сходную экспрессию в толстой кишке по сравнению с подвздошной кишкой (67). Другие гены-транспортеры, которые, как сообщается, экспрессируются в толстой кишке, хотя в основном на низких уровнях, это SLC7A8 (также известный как LAT2), SLC7A7 (также известный как y+LAT1), SLC38A2 [также известный как возбуждающий AA-носитель 1 (EAAC1)], SLC6A6 [также известный как переносчик таурина (TAUT)], SLC3A1 (также известный как транспортный белок нейтральных и основных аминокислот rBAT), SLC7A9 (также известный как B0+AT). ), SLC7A11 [также известный как переносчик цистина/глутамата (XCT)] и SLC7A1 [также известный как переносчик катионных аминокислот с высоким сродством 1 (CAT-1)].Обзор нескольких переносчиков и их экспрессии в толстой кишке человека, а также, когда данные о людях были недоступны, их экспрессии у грызунов можно найти в Supplemental Table 1 .

Экспрессия этих переносчиков в толстой кишке может обеспечивать механизм абсорбции АА и пептидов в толстой кишке; однако доказательства экспрессии мРНК не доказывают, что транспортеры активны или экспрессируются ли они на базолатеральной или апикальной мембране.Функциональные последствия присутствия этих переносчиков в толстой кишке были исследованы лишь в нескольких исследованиях на животных и в лабораторных условиях. Вуэнш и др. (63) исследовали транспорт меченого радиоактивным изотопом субстрата для PEPT1 в перевернутом мешке in vitro, полученном из тонкого и толстого кишечника мышей. Хотя транспорт субстрата был примерно в 10 раз выше в тощей кишке, в дистальном отделе толстой кишки имел место функциональный транспорт с помощью PEPT1. Кроме того, для PAT1 функциональный транспорт в прямую кишку был продемонстрирован in vitro, поскольку транспорт меченого пролина в сегментах кишечника конкурентно ингибировался другим субстратом PAT1, γ-аминомасляной кислотой (ГАМК) (68).Насколько нам известно, данные о функциональном транспорте АК и пептидов многими другими транспортерами в толстой кишке отсутствуют. Кроме того, необходимо оценить функциональный транспорт АК и пептидов переносчиками SLC в толстой кишке человека. Вполне возможно, что многочисленные транспортеры, обнаруживаемые в ткани толстой кишки, особенно активны, когда поступление АК с пищей низкое, и обеспечивают адаптивный механизм, связанный с потреблением белка с пищей.

Выводы

Толстая кишка играет важную роль в белковом и азотном обмене всего организма, в частности, посредством бактериального метаболизма.Микробиота как тонкого, так и толстого кишечника способна синтезировать АК, и было показано, что абсорбция микробных АК происходит в кишечнике. Хотя большая часть диетических аминокислот и пептидов всасывается в тонком кишечнике, их значительное количество может попасть в толстый кишечник. Четко показано всасывание небелкового азота в толстой кишке, способствующее рециркуляции азота и частичному синтезу АК de novo. До сих пор остается открытым вопрос, всасываются ли АК и пептиды через стенку толстой кишки у людей в какой-либо значительной степени.Серия экспериментов на животных потенциально указывает на некоторую ограниченную степень абсорбции. Кроме того, колоноциты обладают способностью поглощать АК, поскольку в них присутствуют переносчики АК и пептидов. Однако не было убедительно продемонстрировано, всасываются ли всасываемые в толстом кишечнике количества диетических аминокислот и пептидов, соответствующие питательным веществам. Будущие исследования должны решить эту проблему либо с использованием соответствующих моделей животных, либо путем окончательного исследования поглощения АК в толстой кишке человека in vivo [например, путем применения сопоставимого экспериментального подхода, использованного Darragh et al.(52) у поросят]. Если имеет место всасывание в толстой кишке, это имеет большое значение для оценки качества пищевого белка у людей, поскольку правильная оценка качества пищевого белка имеет потенциально важные последствия для здоровья, особенно во время беременности и старения, а также у детей.

Благодарности

Обязанности авторов заключались в следующем: все авторы участвовали в поиске литературы и написании рукописи, а также прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи

Ссылки

1

Гош

S

Качество белка в первую тысячу дней жизни

.

Пищевые продукты Nutr Bull

2016

;

37

S14

:

S14

21

.2

21

.2

Baum

JI

,

KIM

IY

,

IY

,

Wolfe

RR

Расход белка и пожилых людей: что является оптимальным уровень приема?

Питательные вещества

2016

;

8

:

E359

.3

ФАО/ВОЗ

Оценка качества белка: отчет совместной консультации экспертов ФАО/ВОЗ, документ ФАО по пищевым продуктам и питанию 51

.

Рим (Италия)

:

ФАО

;

1991

.4

Schaafsma

G

Преимущества и недостатки аминокислотного индекса с поправкой на усвояемость белка (PDCAAS) как метода оценки качества белка в рационе человека

.

Бр Ж Нутр

2012

;

108

(

S 13000

):

S333

6

.5

6

.5

Fenwick

R

,

Knighton

D

,

Muehan

P

Измерение качества белка на PDCAAS (белок индекс аминокислот с поправкой на усвояемость) методика

.

Newslett Int Dairy Fed

1995

;

143

:

40

3

.6

ФАО

Оценка качества пищевого белка в питании человека, отчет экспертной консультации ФАО, документ ФАО о пищевых продуктах и ​​питании №. 92

.

Рим (Италия)

:

ФАО

;

2013

.7

Fuller

M

Определение усвояемости белков и аминокислот в пищевых продуктах, включая последствия синтеза аминокислот кишечными микроорганизмами

.

Бр Ж Нутр

2012

;

108

(

S 2

):

S238

46

.8

MASON

VC

,

VC

,

,

BECH-ANDERSEN

S

Бактериальная активность на заднем кишечник свиней 2. Влияние на кажущуюся усвояемость азота и аминокислот

.

Z Tierphysiol Tierernahr Futtermittelkd

1976

;

36

:

310

24

.9

Stephen

AM

,

Cummings

JH

Вклад микробов в фекальную массу человека

.

J Med Microbiol

1980

;

13

:

45

56

.10

Лоуренс

T

Высококачественные зерновые рационы для свиней на доращивании/откорме: I. Влияние приготовления злаков и количества воды на продуктивность свиней. с высоким содержанием пшеницы

.

J Agric Sci

1967

;

68

:

269

269

74

.11

74

.11

Cole

D

,

DEAN

G

,

LUSCOMBE

J

Одиночные диеты для бекона Свиньи: 2. Эффект методов хранение и подготовка ячменя по продуктивности и убойному качеству

.

Аним Прод

1970

;

12

:

12

:

1

6

.12

,

a

,

jørgensen

h

,

fnerández

j

Корреляции белка нанесены в растущих женских свиньях к илеальному и фекальному усердному сыру белок и аминокислоты

.

Livest Prod Sci

1985

;

12

:

145

59

59

.13

59

.13

Maughan

P

,

SMITH

W

Определение и оценка очевидных коэффициентов расслаиванию аминокислота Ileal amino кислот для растущей свиньи

.

NZ J Agric Res

1985

;

28

:

365

705

70

.14

70

.14

Rutherfurd

,

MOULHAN

PJ

,

MOREL

PJ

,

MOREL

PC

Оценка истинной расслабленности реактивности реактивного лизина в качестве предиктора лизина поглощение из тонкого кишечника растущей свиньи

.

J Agric Food Chem

1997

;

45

:

4378

4378

83

.15

83

.15

Sauer

WC

,

Ozimek

L

Уситаемость аминокислот в свиней: результаты и их практические применения. Обзор

.

Livest Prod Sci

1986

;

15

:

367

:

367

88

.16

Van Weerden

EJ

,

Huisman

J

,

VAN Leeuwen

P

,

SLUP

P

P

Чувствительность Ileal метод переваримости по сравнению с методом фекальной перевариваемости

.In:

Just

A

,

Jorgensen

H

,

Fernandez

JA

редакторы.

Материалы 3-го Международного симпозиума по физиологии пищеварения у свиней.

Копенгаген (Дания)

:

Национальный институт зоотехники

;

1985

. п.

392

5

.17

Moughan

PJ

Доступность аминокислот: аспекты методологии химического анализа и биоанализа

.

Nutr Res Rev

2003

;

16

:

127

127

41

.18

41

.18

Jahan-Mihan

A

,

Luhovyy

BL

,

EL KHOURY

D

,

Anderson

GH

Диетические белки в качестве детерминанты метаболических и физиологических функций желудочно-кишечного тракта

.

Питательные вещества

2011

;

3

:

574

603

.19

Moughan

PJ

,

Stevens

BR

90В:

Stipanuk

MH

,

Caudil

MA

ред.

Биохимические, физиологические и молекулярные аспекты питания человека.

Сент-Луис

:

Эльзевир

;

2012

. п.

162

78

.20

78

.20

Miner-Williamms

WM

,

stevens

,

stevens

br

,

muehan

pj

INTATION Натуральные пептиды поглощены из здоровой кишки у взрослого человека?

Nutr Res Rev

2014

;

27

:

308

29

.21

Muewan

PJ

,

Butts

CA

,

ROWAN

AR

,

Deglaire

A

A

Диетические пептиды Увеличение эндогенных аминокислотных потерь от кишки у взрослых

.

Am J Clin Nutr

2005

;

81

:

1359

1359

65

.22

.22

Bergen

WG

,

WU

G

Кишечный азотный азот и утилизация в здоровье и заболевании

.

Дж Нутр

2009

;

139

:

821

521

5

.23 —

5

.23

Chacko

Chacko

A

,

Cummings

JH

JH

Потери азота от человеческого небольшого кишечника: Обязательные потери и влияние физической формы пищи

.

Гут

1988

;

29

:

809

809

15

.24

GraLa

W

,

BURACZEWSKA

L

,

WAREWKO

J

,

Versтель

MWA

,

Tambinga

S

,

Jansman

AJM

,

Huisman

J

,

Korczynski

W

Поток эндогенных и экзогенных веществ в различных отделах тонкого кишечника в рационе свиней, 90 соевых бобов или жмыха соя-рапса, 90 соевых бобов или жмыха с добавлением сои .

J Anim Feed Sci

1998

;

7

:

1

20

.25 —

Miner-Williams

Williams

W

,

Deglaire

A

,

BenaMouzig

R

,

Fuller

MF

,

Tome

D

,

Moughan

PJ

Эндогенные белки в терминальном отделе подвздошной кишки взрослых субъектов, получавших казеиновую диету

.

Am J Clin Nutr

2012

;

96

:

508

15

.26

VAN Nielen

M

,

M

,

Feskens

EJ

,

Mensink

M

,

SLUIJS

I

,

Molina

E

,

Amiano

P

,

Ardanaz

E

,

Балкау

B

,

Beulens

JW

,

Boeing

H

, и др.

Потребление белка с пищей и заболеваемость диабетом 2 типа в Европе: когортное исследование EPIC-interAct

.

Лечение диабета

2014

;

37

:

1854

:

1854

62

.27

Libao-Merco

AJ

,

ZHU

CL

,

CLIC

JP

,

Lapierre

H

,

Thibaled

JN

,

Seve

B

,

Fuller

MF

,

de Lange

CF

В норме пищевые и эндогенные аминокислоты вносят основной вклад в микробный белок в верхних отделах кишечника

Дж Нутр

2009

;

139

:

109

:

1088

94

.28

94

.28

Mettes

CC

,

LOH

G

Синтез кишечного микробного микробного аминокислота и его важное значение для аминокислотной гомеостаза моногазатрического хоста

. In:

Wolfgang-Bernhard

S

,

Metges

CC

редакторы.

Прогресс в исследованиях энергетического и белкового обмена.

Wageningen (Нидерланды)

:

Wageningen Academic Publishers

;

2003

.п.

579

92

.29

92

.29

Jackson

AA

,

Gibson

NR

,

Bundy

R

,

Hounslow

A

,

Millward

DJ

,

Wootton

SA

Переход (15)N из перорального лактозоуреида в лизин у здоровых взрослых

.

Int J Food Sci Nutr

2004

;

55

:

455

455

62

.30

RAJ

T

,

Dileep

U

,

VAZ

M

,

Fuller

MF

,

Kurpad

AV

Вклад микробов кишечника в метаболический ввод лейцина у взрослых мужчин

.

Дж Нутр

2008

;

138

:

2217

:

2217

2217

21

.31

Torarallardona

D

,

D

,

Harris

CI

,

Fuller

MF

ЛИСИН СИНТЭСИЖЕННЫЙ СИНТЕГИЗИИ желудочно-кишечной микрофлорой свиней, в основном в тонкая кишка

.

Am J Physiol Endocrinol Metab

2003

;

284

:

E1177

:

E1177

80

.32

TRALLARDONA

D

,

D

,

Harris

CI

,

Fuller

MF

Свиньи «Желудочно-кишечная микрофинальная микрофлора обеспечивают их незаменимые аминокислоты

.

Дж Нутр

2003

;

133

:

1127

:

1127

31

.33

Mettes

CC

,

EL-KOURY

AE

,

HENNAMEN

L

,

Petzke

KJ

,

Грант

I

,

BEDRI

S

,

pereira

pp

,

ajami

,

ajami

000002,

,

мф

,

молодой

VR

Наличие кишечного микробного лизина для всего тела лизин гомеостаз в человеческих предметах

.

Am J Physiol

1999

;

277

:

277

:

E597

607

.34

Metges

CC

,

CC

,

Petzke

KJ

,

EL-Khoury

AE

,

Henneman

L

,

Грант

I

,

BEDRI

S

,

REGAN

,

REGAN

мм

,

футов

,

футов

мф

,

мф

,

молодые

VR

Включение мочевины и аммиака азота в Ileal и фекалированные микробные белки и плазменные аминокислоты в нормальных мужчин и илеостомы

.

Am J Clin Nutr

1999

;

70

:

1046

:

1046

58

.35

58

.35

Gibson

SA

,

McFarlan

C

,

,

C

S

,

MacFarlane

GT

GT

Значение микрофлоры в протеолизе в двоеточие

.

Appl Environ Microbiol

1989

;

55

:

55

:

679

:

879

83

.36

83

.36

Smith

Ea

,

MacFarlane

GT

Перечисление аминокислотных ферментирующих бактерий в толстой кишечнике: эффекты рН и крахмала на пептидный метаболизм и диссимиляция аминокислот

.

FEMS Microbiol Ecol

1998

;

25

:

355

355

68

.37

Davila

,

Blachier

F

,

Gotteland

F

M

,

Andriamihaja

M

,

Benetti

PH

,

Sanz

Y

,

Tome

D

Перепечатка «Азотистый обмен в просвете кишечника: роль кишечной микробиоты и последствия для хозяина.

Pharmacol Res

2013

;

69

:

114

114

26

.38

Nyangale

Nyangale

EP

,

MOTTRAM

DS

,

GIBSON

GR

ГУТ Микробная активность, последствия для здоровья и болезни: потенциальная роль анализ метаболитов

.

J Proteome Res

2012

;

11

:

5573

8573

85

.39

.39

неправильный

OJ

,

Edmonds

CJ

,

Chadwick

VS

Большой кишечник: его роль в питании млекопитающих и гомеостаза.

Ланкастер (Великобритания)

:

MTP Press Ltd.

;

1981

.40

McNeil

NI

Вклад толстого кишечника в энергоснабжение человека

.

Am J Clin Nutr

1984

;

39

:

39

338

42

.41

42

.41

James

PS

,

SMITH

MW

METOIONINE TRANSPORT COM COLONION Mucosa измерены в рамках раннего развития посттал

.

Дж Физиол

1976

;

262

:

151

68

.42

68

.42

SMITH

MW

,

James

PS

Аминокислотный транспорт по геликомальной толстой кишечной кишечной кишечной кишечной кишечнице

.

Биохим Биофиз Акта

1976

;

419

:

419

:

419

4

.43 —

4

.43

Джеймс

PS

,

PS

,

SMITH

MW

,

Вудяные

MW

,

Вудяные

FB

Материалы: зависимые от времени изменения в транспортировке метионина по всей территории новорожденная свинья

.

Дж Физиол

1976

;

257

:

38P

9P

.44

9P

.44

Sepúlveda

FV

,

SMITH

MW

МВт

Различные механизмы для нейтральной аминокислоты поглощения новой свиной кишки

.

Дж Физиол

1979

;

286

:

479

90

.45

Zebrowska

T

Переваривание и всасывание азотистых соединений в толстом кишечнике свиней

.

Рочнники Наук Рольничич

1973

;

95B

:

85

90

.46

Zebrowska

T

Кажущаяся усвояемость азота и отдельных аминокислот в толстом кишечнике свиней 90

Рочнники Наук Рольничич

1975

;

97b

:

117

23

.47 —

23

.47

Hodgson

ES

,

ES

,

Horney

FD

,

Bayley

HS

азотный метаболизм в свиньях, получающих соевые и рапсовые блюда

.

Can J Anim Sci

1977

;

57

:

832

:

832

.48

Columbus

DA

,

DA

,

,

H

,

HTOO

H

,

HTOOO

JK

,

de lange

CF

Непротеин азот поглощается из толстой кишки и увеличивается баланс азота у растущих свиней, получавших диету с ограничением валина

.

Дж Нутр

2014

;

144

:

614

20

.49

Gargallo

J

,

Zimmerman

D

Влияние инфузии казеина и крахмала в толстой кишке на азотистый обмен растущих свиней

.

Дж Нутр

1981

;

111

:

1390

1390

6

.50

всего

,

jorgensen

H

,

Fernandez

JA

JA

Пищеварительная емкость Caecum-Colon и значение азота всасывается из задней кишки для синтеза белка у свиней

.

Бр Ж Нутр

1981

;

46

:

209

19

.51

Фуллер

MF

,

Ридс

PJ

3 90 Цикл азота в кишечнике

Годовой Рев Нутр

1998

;

18

:

385

:

385

411

.52

411

.52

darragh

aj

,

Cranwell

PD

,

Muehan

PJ

PJ

Поглощение лизина и метионина из проксимальной толстой кишки поросята

.

Бр Ж Нутр

1994

;

71

:

719

:

739

52

.53

Wünsche

J

,

Hennig

U

,

MEINL

M

,

Kreienbring

F

,

Bock

HD

[Поглощение и использование аминокислот, введенных в слепую кишку растущих свиней. 1. Измерение N-баланса для утилизации лизина и изолейцина; потребность в изолейцине для растущих свиней]

.

Arch Tierernahr

1982

;

32

:

32

:

337

337

48

.54

Krawielitzki

K

,

Schadeereit

R

,

Völker

T

,

Bock

HD

HD

[Поглощение и утилизация аминокислот вводят в слепую кишку растущих свиней. 2. 15N-меченый лизин]

.

Arch Tierernahr

1982

;

32

:

445

54

.55

Krawielitzki

K

,

K

,

r

k

R

,

Wünsche

J

,

Völker

,

Völker

T

,

Bock

HD

HD

[Поглощение и утилизация аминокислот, введенных в крему растущая свинья. 3. Исследования с 15N- и 14С-меченым изолейцином]

.

Arch Tierernahr

1983

;

33

:

731

731

42

.56

Krawielitzki

K

,

Schadeereit

R

,

Zebrowska

T

,

Wünsche

J

,

Bock

HD

[Поглощение и использование аминокислот, введенных в слепую кишку растущих свиней.4. Сравнительные исследования перорального или кишечного введения 15N-лизина и 15N-мочевины соответственно]

.

Arch Tierernahr

1984

;

34

:

1

18

.57

Niiyama

Niiyama

M

,

DEGOCHI

E

,

KAGOTA

K

,

NAMIOKA

S

Внешний вид 15N-меченного микробов кишечника аминокислоты в венозной крови толстой кишки свиньи

.

Am J Vet Res

1979

;

40

:

716

8

.58

Slade

LM

,

епископ

R

,

R

,

MORRIS

JG

,

Robinson

DW

DW

Пищеварение и поглощение 15N-меченого микробного белка в толстой кишечнике лошади

.

Бр Вет Дж

1971

;

127

:

127

:

11

3

.59

Olszewski

A OLSZEWSKI

A

,

BURACZEWSKI

S

Абсорбция аминокислот в изолированной свиньи Caecul in Situ.Влияние концентрации ферментативного гидролизата казеина на абсорбцию аминокислот

.

Acta Physiol Pol

1978

;

29

:

67

77

. 60

77

.60

Woodward

AD

,

Вентилятор

MZ

RJ

Geor

RJ

,

MCCutcheon

LJ

,

Taylor

NP

,

Trottier

NL

Характеристика транспорта L-лизина через мембрану щеточной каймы тощей и толстой кишки лошадей и свиней

.

J Anim Sci

2012

;

90

:

853

:

853

62

.61

Heine

W

,

Wutzke

KD

,

Richter

I

,

Walther

F

,

PLATH

C

Доказательства абсорбции белкового азота толстой кишкой у младенцев

.

Acta Paediatr Scand

1987

;

76

:

741

:

741

4

.62

Hendriks

WH

,

VAN BAAL

J

,

BOSCH

G

Ileal и Faecal Белковое расслабляемость Усистема у людей и других нежилых животных — сравнительный видовой вид

.

Бр Ж Нутр

2012

;

108

(

S 2

):

S247

57

.63

57

.63

Wuensch

T

,

Schulz

S

,

Ullrich

S

,

LILL

N

,

STELZL

T

,

T

,

RUBIO-ALIAGA

I

,

LOH

G

,

Chamaillard

M

,

,

M

,

,

Daniel

D

,

Daniel

H

Пептид Transporter Pept1 выражается в дистального отдела толстой кишки у грызунов и человека и способствует абсорбции воды

.

Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol

2013

;

305

:

G66

:

G66

73

.64

Prasad

PD

,

Wang

H

,

Huang

W

,

kekuda

R

,

Rajan

DP

,

Leibach

FH

,

Ganapathy

V

LAT1 человека, субъединица транспортера аминокислот системы L: функция молекулярного клонирования и транспорта

.

Biochem Biophys Res Commun

1999

;

255

:

283

:

8

.65 —

8

.65 —

Nishimura

M

,

M

,

Naito

S

Специфичные ткани Экспрессии мРНК. Профили экспрессии человеческого растворенного перевозчика суперфамилии

.

Лекарственное средство Метаб Фармакокинет

2008

;

23

:

23

:

22

44

.66

44

.66

Nishimura

Nishimura

M

,

M

,

Naito

S

Специализированная ткань MRNA. Профили экспрессии мРНК-мРНК-атпор-связывающей кассеты и растворенного перевозчика переносчика SuperFamilies

.

Препарат Метаб Фармакокинет

2005

;

20

:

452

452

77

.67

anderson

см

,

Howard

A

,

Walters

JR

,

Ganapathy

V

,

Thwaites

DT

Поглощение таурина через мембрану щеточной каемки кишечника человека осуществляется через два переносчика: H+-связанный PAT1 (SLC36A1) и Na+- и Cl(-)-зависимый TauT (SLC6A6)

.

Дж Физиол

2009

;

587

:

731

44

.68

44

.68

Broberg

M

,

Holm

R

,

Tønsberg

H

,

Frulund

S

,

Ewon

Kb

,

Nielsen

A

,

A

,

Brodin

B

,

Jensen

A

,

Kall

MA

,

Christensen

KV

et al.

Функция и экспрессия протонно-связанного переносчика аминокислот PAT1 в желудочно-кишечном тракте крыс: влияние на всасывание габоксадола в кишечнике

.

Br J Pharmacol

2012

;

167

:

654

65

.

Сокращения

  • AA

  • Dias

    DiageSitible Endispensable аминокислотный счет

  • LAT

    L-типа аминокислотный транспортер

  • PD-CAAS

    Белковочная обработка белков Исправление аминокислоты

  • SLC

© Американское общество питания, 2017 г.

различных популяций стволовых клеток человека в тонком и толстом кишечнике

Abstract

Кишечник состоит из эпителиального слоя, содержащего быстро пролиферирующие клетки, которые созревают в двух областях: тонкой и толстой кишке.Хотя предыдущие исследования идентифицировали стволовые клетки как клетки-источники эпителиальных клеток кишечника, ни в одном исследовании не проводилось прямого сравнения стволовых клеток, полученных из этих анатомически различных областей. Здесь мы изучаем внутренние различия между первичными эпителиальными клетками, выделенными из тонкой и толстой кишки плода человека, после экспансии in vitro с использованием агониста Wnt R-спондина 2. Мы использовали проточную цитометрию, флуоресцентно-активированную сортировку клеток, анализ экспрессии генов и трехмерный анализ дифференцировки in vitro для характеристики их свойств стволовых клеток.Мы идентифицировали маркеры стволовых клеток, которые разделяют субпопуляции колониеобразующих клеток в тонкой и толстой кишке, и выявили важные различия в дифференцировке, пролиферации и путях заболевания с помощью анализа экспрессии генов. Отдельные клетки из культур тонкого и толстого кишечника сформировали органоиды, которые отражают отчетливую клеточную иерархию, обнаруженную in vivo , и по-разному реагируют на идентичные экзогенные сигналы. Наша характеристика выявила многочисленные различия между эпителиальными стволовыми клетками тонкого и толстого кишечника, что указывает на возможную связь с кишечными заболеваниями.

Образец цитирования: Cramer JM, Thompson T, Geskin A, LaFramboise W, Lagasse E (2015) Различные популяции стволовых клеток человека в тонком и толстом кишечнике. ПЛОС ОДИН 10(3): e0118792. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0118792

Академический редактор: Jun Sun, Медицинский центр Университета Раш, США

Получено: 15 августа 2014 г.; Принято: 6 января 2015 г .; Опубликовано: 9 марта 2015 г.

Авторское право: © 2015 Cramer et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах статья и ее вспомогательные информационные файлы, за исключением данных массива генов. Данные массива генов, представленные в рукописи, были депонированы в Омнибусе экспрессии генов NCBI под аннотацией: GSE56525.

Финансирование: Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения DK085711 (EL) и грантом поддержки онкологического центра Национального института рака P30 CA 47904 (WL). Описанный проект был также поддержан номером премии T32EB001026-06 от Национального института биомедицинской визуализации и биоинженерии. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института биомедицинской визуализации и биоинженерии или Национального института здоровья.Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Кишечник состоит из двух основных отделов: тонкого кишечника (SI) и толстого кишечника (LI), которые различаются по структуре и функциям. SI в значительной степени отвечает за переваривание и усвоение пищи, в то время как LI помогает окончательному поглощению воды и удалению отходов.Среди др. сигнальных путей Wnt и Notch контролируют четко определенную эпителиальную иерархию в кишечнике, помогая поддерживать гомеостаз стволовых клеток. Поскольку эти пути требуют рецепторов, лигандов и регуляции транскрипции, неясно, обусловлены ли различия, наблюдаемые между SI и LI, главным образом внутренними или внешними механизмами [1,2]. Понимание этих различий имеет решающее значение, поскольку неспособность кишечных стволовых клеток правильно пролиферировать и дифференцироваться может привести к раку, который в 20 раз чаще встречается при LI, чем при SI у людей [3].Однако тщательное исследование происхождения различий между SI и LI еще предстоит провести.

Идентификация и характеристика стволовых клеток в кишечнике в последние годы развивались довольно быстро. In vivo исследований по отслеживанию клонов выявили богатые лейцином повторы, содержащие рецептор 5, связанный с G-белком (LGR5) + , стволовые клетки мыши как клетки, способные генерировать все эпителиальные клетки кишечника и формировать криптоподобные структуры. in vitro [4,5].Интересно, что LGR5 сложным образом участвует в синергической активации пути Wnt через семейство белков R-Spondin, которое отвечает за формирование и поддержание гомеостатических крипт в кишечнике [6-8]. Этот путь также обычно изменяется при раке толстой кишки посредством мутации аденоматозного полипоза толстой кишки (APC), вызывающей накопление бета-катенина в ядре и усиление передачи сигналов Wnt [9,10]. Быстро растущие аденомы формируются у мышей после делеции APC в стволовых клетках кишечника LGR5 + , что позволяет предположить, что нормальные стволовые клетки являются клетками происхождения рака кишечника [11].Кроме того, мышиные аденомы показали постоянную активность стволовых клеток LGR5 + , предоставляя функциональные доказательства популяции раковых стволовых клеток в первичных аденомах кишечника [12].

Путь Wnt имеет обширные перекрестные связи с путем Notch в его контроле над решениями клеточных судеб, пролиферацией и онкогенезом [1,13,14]. Более конкретно, активация пути Notch подавляет дифференцировку секреторных клеток, но ингибирование пути Notch приводит к активации атонального гомолога 1 (ATOh2), способствующего дифференцировке бокаловидных клеток (S1, рис.) [1,15,16]. До сих пор в большинстве исследований, выясняющих эти пути в кишечнике, не проводилось четких различий между SI и LI, возможно, упущены различия с важными последствиями.

Большинство характеристик кишечных стволовых клеток было выполнено на животных моделях, потому что клетки из нормального кишечника человека очень трудно выращивать in vitro , а отслеживание клонов практически невозможно провести у людей. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы использовали фидерные клетки в качестве стромального слоя для обеспечения межклеточных взаимодействий с клетками кишечника человека и стимулирования роста эпителиальных клеток [17].Наша лаборатория ранее использовала эту систему для выделения и размножения опухолевых клеток со свойствами стволовых клеток (раковые стволовые клетки, CSC) из метастатического рака толстой кишки человека [18]. Здесь мы выделили кишечные клетки плода человека из первичной ткани и размножили клетки на фидерном слое. Другие модели in vitro успешно использовались для изучения и понимания биологии стволовых клеток, например трехмерная система, представленная Сато и др. [5]. Важно отметить, что мы сравнили клетки, выращенные из SI и LI, выделенные из одной и той же донорской ткани, минимизировав потенциальные расхождения из-за генетической изменчивости.Мы также размножали клетки SI и LI в идентичных условиях культивирования, чтобы можно было сравнить внутренне запрограммированные различия. Обогащенные стволовыми клетками культуры из SI и LI человека позволили нам сравнить стволовые клетки и свойства дифференцировки, чтобы определить ключевые различия между этими двумя клеточными популяциями с возможными последствиями для возникновения заболеваний в этих двух областях кишечника.

Результаты

Эпителиальные клетки SI и LI, размноженные in vitro, обогащены клетками, экспрессирующими маркеры стволовых клеток

Для исследования потенциала in vitro клеток, выделенных из SI и LI, мы использовали ткани кишечника человека примерно на 23-й неделе беременности.На этой стадии крипты как в SI, так и в LI плода структурно аналогичны криптам, наблюдаемым у взрослых, и состоят из эпителиальных клеток всех клонов, за исключением большего количества бокаловидных клеток в ткани плода (Fig. 1A). Мы использовали фидерный слой для расширения клеток из SI и LI, поскольку ранее было показано, что он расширяет CSC толстой кишки человека из образцов метастатического рака толстой кишки [18]. Кроме того, мы обнаружили, что рост нормальных кишечных клеток плода на фидерном слое требует добавления R-spondin 2, агониста Wnt, действующего через рецептор LGR5 [8,19].Это неудивительно, учитывая, что R-spondin 1, как известно, важен для in vitro экспансии кишечных клеток, и все четыре R-spondins связывают одно и то же семейство рецепторов и, как ожидается, будут несколько повторяющимися [5,8]. Всего было выделено и обработано для культивирования на фидерном слое 29 пар SI и LI. После посева примерно 80 000 первичных клеток/см 2 только 18 пар образовали редкие колонии примерно через две недели (уровень успеха 62%), что указывает на то, что только небольшая популяция клеток из первичной ткани была способна выжить при селекции в этих условиях культивирования.Некоторые образцы были намного более эффективны в формировании колоний, чем другие, в результате чего предполагаемый диапазон эффективности составил 0,00015–0,005%. Последовательное пассирование приводило к более сильному размножению кишечных клеток. Фенотипические различия в плотности колоний, размере и форме клеток наблюдались между клетками, выросшими из SI и LI, и их можно было пассировать не менее 10 раз без видимых морфологических изменений или онкогенной трансформации (рис. 1B и таблица S1). После размножения первичных клеток in vitro анализы проточной цитометрии выявили обогащение эпителиальных клеток, отмеченное молекулой эпителиальной клеточной адгезии (EPCAM), из 21.от 6 до 92,3% в клетках, размножающихся из SI, и от 34,3% до 92,4% в клетках, размножающихся из LI (рис. 1C&D). Для всех культур эпителиальных клеток SI и LI исследовали более двадцати маркеров клеточной поверхности. Наиболее воспроизводимые и релевантные маркеры указывали на то, что расширенные кишечные клетки экспрессировали несколько маркеров, связанных со стволовостью. CD133.1 (AC133) был предложен в качестве маркера РСК в кишечнике [20–22], а также маркера нормальных стволовых клеток, таких как гемопоэтические стволовые клетки [23] или нейрональные стволовые клетки [24].В то время как первичные клетки из SI и LI содержали менее 1% клеток CD133.1 + , примерно 70% размноженных клеток экспрессировали CD133.1 (рис. 1E). Другие предполагаемые маркеры стволовых клеток продемонстрировали сходные профили экспрессии, включая CD166 [25] и CD24 [26], экспрессия которых выше, чем у первичных клеток, подобно CD133.1 (рис. 1F и данные не показаны) [18]. В предыдущем исследовании с использованием тканей человека в возрасте от трех месяцев до восемнадцати лет сообщалось о выделении, характеристике и расширении популяций стволовых клеток из отдельных клеток [27].Были предприняты попытки размножить первичные кишечные клетки плода после сортировки клеток, но из отсортированных первичных клеток не было получено прочных долговременных колоний. Различия в развитии пренатальных, постнатальных и взрослых тканей могут объяснить нашу неспособность генерировать долговременные колонии из одиночных клеток. Окружающая среда гораздо более динамична и муцинозна в пренатальном состоянии развития, даже несмотря на то, что присутствуют структуры, подобные взрослым. Поэтому мы увеличили объем эпителиальных клеток кишечника in vitro непосредственно из диссоциированной ткани перед дальнейшей характеристикой.

Рис. 1. Размноженные in vitro первичные эпителиальные клетки из тонкой и толстой кишки плода человека экспрессируют маркеры стволовых клеток.

A-F , верхние панели: тонкая кишка, нижние панели: толстая кишка ( A ) Парафиновые срезы кишечника плода с гематоксилином и эозином на 23 неделе беременности. ( B ) Кишечные клетки разрослись в питающем слое (желтый контур). ( C-F ) Репрезентативный анализ первичных и размноженных клеток в пассажах 4, 5 или 6 с указанием процентной доли живых клеток с гейтом.( C ) Проточный цитометрический анализ (точечные диаграммы) свежевыделенных первичных клеток кишечника. Стратегия гейтирования определяет общее количество живых клеток (левые панели) и клетки EPCAM + , исключая клетки крови (CD45 + CD235a + ) (правые панели). ( D ) Проточный цитометрический анализ размноженных клеток. Стратегия гейтирования определяет общее количество живых клеток (левые панели) и клетки EPCAM + , за исключением клеток фидерного слоя грызунов (HLA ) (правые панели). ( E ) Проточный цитометрический анализ (контурные графики вероятности 5%) первичных и расширенных клеток кишечника, окрашенных EPCAM и CD133.1. ( F ) Разросшиеся кишечные клетки также экспрессируют другие предполагаемые маркеры стволовых клеток. Гистограммы представляют неокрашенный контроль (синий) и окрашенные CD166 или CD24 (красный) живых клеток EPCAM + . Масштабные линейки = 100 мкм для панелей A и B.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0118792.g001

Дифференциальная экспрессия поверхностных маркеров стволовых клеток разделяет несопоставимую колониеобразующую активность в клетках, размноженных из SI и LI

Мы наблюдали большую экспрессию CD133.1 в клетках размножались из LI по сравнению с SI, в то время как CD13, аминопептидаза, ответственная за гидролиз N-концевых аминокислот на мембране щеточной каймы, демонстрировала более высокую экспрессию в SI (рис. 2А). [28]. Кроме того, уровень CD66c, также известный как молекула клеточной адгезии, связанная с карциноэмбриональным антигеном 6 (CEACAM6), был заметно выше в клетках, размножающихся из SI (79,8% CD66c hi ), по сравнению с клетками, размножающимися из LI (89,4% CD66c low ). (рис. 2А). Эти тенденции были постоянными в расширенных клетках из трех парных образцов SI и LI, как видно из профилей индекса окрашивания (рис.2Б). Индекс окрашивания описывает степень, в которой положительная популяция отличается от популяции отрицательного контроля.

Рис. 2. Разросшиеся клетки тонкой и толстой кишки демонстрируют различную экспрессию маркеров клеточной поверхности.

( A ) Проточный цитометрический анализ экспрессии CD133.1, CD13 и CD66c на размноженных клетках из одного парного образца SI и LI (изображенные здесь SI и LI происходят из одного и того же источника ткани). Гистограммы показывают один репрезентативный набор из трех исследованных парных образцов, представляющих неокрашенный контроль (синий) и окрашенные живые клетки EPCAM + (красный).Для CD66c представлен процент клеток с низкой и высокой экспрессией. Все маркеры были PE-мечены. Один и тот же контроль использовали для SI CD13 и CD66c, а также для LI CD133 и CD13, поскольку окрашивание проводили в одно и то же время. ( B ) Соответствующий индекс окрашивания трех парных образцов, показывающий воспроизводимые результаты между парными образцами SI и LI (1, 2 и 3) (индекс окрашивания = D/W, где D — расстояние между положительными и отрицательными популяциями, а W два стандартных отклонения отрицательной популяции).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0118792.g002

Чтобы продемонстрировать функциональную важность дифференциальной экспрессии маркеров клеточной поверхности, мы использовали анализ предельных разведений (LDA) для оценки клоногенного потенциала популяций эпителиальных клеток. производные от SI и LI. LDA представляет собой количественное измерение, которое может определить частоту образования колоний конкретной клеточной популяции. Увеличение частоты образования колоний коррелирует с активностью стволовых клеток [29].Поскольку CD66c показал гетерогенный и противоположный паттерн экспрессии в клетках, выросших из SI и LI, мы спросили, может ли он различать способность к колониеобразованию в этих двух популяциях эпителиальных клеток кишечника. Используя сортировку клеток, активируемую флуоресценцией (FACS), мы отсортировали расширенные клетки из трех образцов SI и LI, соответствующих тканям, в предельном разведении на основе высокой и низкой экспрессии CD66c. Через четыре недели после посева мы рассчитали частоту колониеобразующих единиц (КОЕ) клеток с помощью линейной регрессии [30].Частота встречаемости колониеобразующих клеток EPCAM + в SI и LI была одинаковой и колебалась от 1/10 до 1/106. Интересно, что клетки, размножающиеся из SI, которые экспрессировали низкие уровни CD66c, имели более высокую частоту КОЕ, чем клетки CD66c hi , в то время как результаты LDA для клеток, размножающихся из LI, были обратными (таблица 1). Таким образом, даже несмотря на то, что большинство клеток, выросших из SI, представляют собой CD66c hi , как видно из индекса окрашивания (рис. 2B), субпопуляция клеток CD66c low представляет собой клетки с большей способностью к колониеобразованию (таблица 1). .Противоположное верно для клеток, полученных из LI. Как следствие, несоответствие в экспрессии CD66c можно использовать для обогащения размноженных клеток SI и LI потенциалом самообновления.

Анализ экспрессии генов эпителиальных клеток, размноженных из SI и LI, показал отдельные молекулярные сигнатуры и различную внутреннюю регуляцию

Мы показали, что разросшиеся эпителиальные клетки из SI и LI обогащены стволовыми клетками кишечника, о чем свидетельствует их зависимость от R-спондина 2, их экспрессия маркеров стволовых клеток (рис.1) и высокой частотой их колониеобразования (табл. 1). Затем мы использовали анализ массива генов, чтобы определить, демонстрируют ли клетки, размножающиеся из SI и LI, различия в своих молекулярных сигнатурах (NCBI Gene Expression Omnibus: GSE56525). Среди 21 238 проб на каждом массиве 3274 пробы значительно отличались друг от друга. После удаления зондов для одного и того же гена кратность экспрессии 1118 транскриптов превышала 1,5. Ячейки, расширенные из SI и LI, сгруппированы отдельно с использованием методов неконтролируемой иерархической кластеризации, где расстояния определяются линейно (левая ось, рис.3А). Таким образом, даже несмотря на то, что мы не смогли различить субрегионы в ткани SI (подвздошная кишка, тощая кишка и т. д.), мы не обнаружили каких-либо существенных различий или гетерогенности среди многих исследованных образцов SI. Кроме того, хотя возраст наших образцов варьировался от 20 до 23 недель, эта переменная считалась несущественной из-за правильной кластеризации экспрессии генов среди образцов SI и LI.

Рис. 3. Анализ массива генов выявил различные молекулярные сигнатуры между клетками, размноженными из SI и LI.

( A ) Тепловая карта дифференциально экспрессируемых транскриптов расширенных эпителиальных клеток из SI по сравнению с LI.Неконтролируемая кластеризация была выполнена по значениям экспрессии гена log2 (алгоритм K-средних) с отсечкой q<0,05 (FDR = 5%). Значения экспрессии масштабируются для минимального (синий) и максимального (красный) значений интенсивности. Расширенные клетки сформировали отдельные кластеры в зависимости от происхождения клеток (SI или LI). ( B-D ) Гистограммы отображают значительную (q<0,05) дифференциальную экспрессию отдельных генов между клетками, расширенными из SI и LI, классифицированных в канонические пути с использованием анализа путей изобретательности (см. Методы).Все значения представлены как среднее (прямоугольник) плюс стандартное отклонение (планка погрешности) необработанной интенсивности для каждой записи. Список названий генов можно найти в таблице S2.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0118792.g003

Затем мы использовали программное обеспечение Ingenuity Pathway Analysis для прогнозирования изменений экспрессии в наборе данных, связанных с биологическими процессами и болезнями. Функциональные различия в экспрессии генов между SI и LI часто появлялись при известных путях развития рака и желудочно-кишечных заболеваний.Транскрипты с наибольшими кратными изменениями между SI и LI были связаны с пролиферацией, адгезией, миграцией и теми, которые сообщали о функциях при раке и метастазировании. Связанные с опухолью транскрипты были экспрессированы значительно выше в клетках, размноженных из LI, по сравнению с SI (рис. 3B). Мы также обнаружили различия в транскриптах путей Wnt и Notch (Fig. 3C&D). ПЦР в реальном времени выбранных генов подтвердила дифференциальную экспрессию, обнаруженную при анализе массива генов (рис. S2). Вместе анализ экспрессии размноженных клеток показал отчетливую внутреннюю регуляцию между SI и LI на уровне стволовых клеток.

Размноженные клетки из SI и LI продемонстрировали мультипотенциальность и по-разному реагировали на экзогенные сигналы в трехмерной культуре

Кишечные стволовые клетки частично определяются их мультипотенциальностью, поэтому мы исследовали способность размноженных кишечных клеток дифференцироваться в различные линии кишечных клеток. Мы адаптировали ранее определенную трехмерную систему культивирования для стимулирования дифференцировки клеток in vitro [5]. После расширения фидерного слоя для устранения дифференцированных клеток и создания более гомогенной клеточной популяции суспензии отдельных клеток заливали матригелем и покрывали средой, содержащей факторы роста, которые, как известно, важны для пролиферации и дифференцировки стволовых клеток кишечника [19] (см. Методы и рис.4А). Использование ингибитора γ-секретазы (GSI), такого как трет-бутиловый эфир N-[N-(3,5-дифторфенацетил)-1-аланил]-S-фенилглицина (DAPT), блокирует транслокацию внутриклеточного домена Notch. (NICD) к ядру для передачи сигналов вниз по течению, вызывая форсированную дифференцировку в бокаловидные клетки [16,19,31]. Разросшиеся кишечные клетки сохраняли способность дифференцироваться и формировать слой эпителиальных клеток вокруг центрального просвета с клеточной иерархией и архитектурой, сходной с найденной in vivo (рис.4Б). Тщательное отслеживание отдельных клеток показало рост в многоклеточные органоиды, что подтверждает клональное происхождение, по крайней мере, некоторых органоидов SI и LI (S3 Fig.). Кроме того, мы наблюдали морфологические различия между органоидами SI и LI с появлением ветвящихся структур в SI и сферических структур в LI (рис. 4Б).

Рис. 4. Анализ трехмерной дифференцировки клеток, размноженных из SI и LI.

( A ) Экспериментальный план трехмерного анализа.Размноженные кишечные клетки были встроены как отдельные клетки в Matrigel, сначала размножены в среде стволовых клеток (SC), а затем дополнительно обработаны средой SC, средой для дифференцировки или средой для дифференцировки + DAPT (GSI). ( B ) In vitro и изображения H&E органоидов SI (вверху) и LI (внизу) в каждом из трех видов лечения. Один парный набор органоидов SI и LI является репрезентативным для трех исследованных наборов. Масштабная линейка = 50 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0118792.g004

Используя иммунофлуоресцентное окрашивание для маркеров дифференцировки, мы проанализировали органоиды SI и LI на наличие зрелых клеток кишечника. Экспрессия муцина 2 (MUC2), маркера зрелых бокаловидных клеток, значительно увеличивалась при обработке средой для дифференцировки без DAPT и с DAPT (Diff и Diff+DAPT) как в органоидах SI, так и в LI (рис. 5A-C). Это коррелировало с появлением вакуолизированных клеток при обоих вариантах дифференцировки в органоидах SI (рис. 4B). Органоиды SI также показали повышенную экспрессию хромогранина А (CHGA), маркера энтероэндокринных клеток, при обработке дифференцировкой (фиг.5А и С). В тех же условиях органоиды LI не экспрессировали каких-либо измеримых количеств CHGA (фиг. 5B). Аналогичное явление также наблюдалось in vivo , где наблюдалось значительно большее количество клеток CHGA + в SI по сравнению с LI (рис. S4). Кроме того, энтероцитарная экспрессия Villin (VIL1) в органоидах SI экспрессировалась в основном в цитоплазме, но была специфически локализована на апикальной клеточной поверхности в дифференцированных органоидах LI (S5 Fig.).

Рис. 5.Иммунофлуоресцентное окрашивание кишечных органоидов подтверждает мультипотенциальность и потенциал дифференцировки.

( A ) SI и ( B ) LI органоиды из одного парного образца, окрашенные на эпителиальный маркер, EPCAM (зеленый), маркер бокаловидных клеток, MUC2 (красный) и энтероэндокринный маркер, CHGA (красный), обработанные средой SC , Среда для дифференциации (Diff) или Среда для дифференциации + DAPT. Контрастное окрашивание, Hoechst 33342. Белые стрелки указывают на положительные клетки. Масштабная линейка = 50 мкм. ( C ) Количественное определение процента бокаловидных или энтероэндокринных клеток от общего количества клеток в поле зрения.В органоидах, полученных из LI, присутствовало недостаточно энтероэндокринных клеток для количественного определения. Этот парный набор служит представителем двух рассмотренных наборов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0118792.g005

Экспрессия генов в органоидах SI и LI различалась в ответ на стимулы дифференцировки

ПЦР в реальном времени показала повышенную относительную экспрессию мРНК ATOh2 и MUC2 в органоидах SI после обработки дифференцировкой (фиг.6А). В органоидах LI экспрессия MUC2 увеличивалась при воздействии сигналов дифференцировки, в то время как экспрессия ATOh2 была незначительной (фиг. 6B). Кроме того, в то время как экспрессия CHGA неуклонно увеличивалась при обработке дифференцировкой в ​​органоидах SI, заметной экспрессии CHGA в органоидах LI не наблюдалось, что подтверждает наши данные иммунофлуоресценции (фиг. 6B и фиг. 5A и B). Кроме того, как и ожидалось, экспрессия маркера стволовых клеток и участника пути Wnt LGR5 снижалась в органоидах SI после обработки дифференцировкой.Неожиданно, однако, LGR5 воспроизводимо увеличивался в органоидах LI после добавления среды Diff и возвращался к уровням среды стволовых клеток (SC) только после обработки DAPT (рис. 6C и D). Мы также обнаружили, что рецептор EPH B2 ( EPHB2 ), еще один предполагаемый маркер стволовых клеток кишечника [32], постоянно увеличивался при обработке Diff органоидов LI. В органоидах SI EPHB2 оставались неизменными в среде Diff, но впоследствии уменьшались при добавлении DAPT. Кроме того, онкоген MYC , мишень Wnt, также уменьшался после воздействия на органоиды SI обработки дифференцировкой, но значительного изменения экспрессии в органоидах LI не наблюдалось.

Рис. 6. Органоиды тонкого и толстого кишечника различаются в ответ на сигналы дифференцировки.

ПЦР-анализ в реальном времени ( A&C ) SI и ( B&D ) LI органоидов, полученных из размноженных клеток и обработанных средой SC, средой для дифференцировки (Diff) или средой Diff + DAPT. Значения обработки SC-среды, использованные в качестве контроля, равны 1. Diff-среда и Diff-среда + значения экспрессии DAPT относятся к SC-среде. См. ключ среды на панели A. ( E ) Сравнение экспрессии выбранного маркера между органоидами SI и LI в трех обработках.Значения SI использовались в качестве контроля и были установлены на 1. Значения экспрессии органоидов LI относились к органоидам SI. Полные названия генов см. в тексте. Экспрессию нормализовали до мРНК GAPDH . Планки погрешностей представляют верхний и нижний пределы ошибок, основанные на повторной изменчивости (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, # выражение не обнаружено). (n = 3 лунки на пару образец/праймер). Один парный набор SI и LI служит представителем всех рассмотренных парных наборов.

https://дои.org/10.1371/journal.pone.0118792.g006

Затем мы сравнили органоиды SI и LI непосредственно на каждом из трех этапов лечения и снова обнаружили неопределяемую экспрессию ATOh2 в органоидах LI, тогда как органоиды SI показали значительную экспрессию ATOh2 . Экспрессия LGR5 и MYC была значительно выше в органоидах LI по сравнению с органоидами SI во всех условиях матригеля (фиг. 6E). В совокупности результаты анализа дифференцировки подтверждают анализ массива генов (рис.3C&D) и демонстрируют, что клетки, выросшие из SI и LI, обладают свойством стволовых клеток мультипотенциальности, но различаются по своей реакции на одни и те же сигналы окружающей среды.

Обсуждение

В этом исследовании мы использовали парные наборы SI и LI плода человека для изучения различий между двумя отдельными анатомическими областями с потенциально разными популяциями стволовых клеток. В то время как другие успешно культивировали органоиды из тканей мыши и/или человека разного возраста [5, 19, 27, 32], за исключением 20–23-недельной ткани плода человека, как здесь используется, ни один из них не сравнил напрямую внутренние различия SI и LI. In vivo комбинация внутренних и внешних факторов определяет структурные и клеточные компоненты SI и LI [33]. Здесь мы устранили любые различия, присутствующие в средах SI и LI, предоставив идентичные факторы роста и условия культивирования для клеток SI и LI. Таким образом, различия, наблюдаемые в спецификации линии клеток in vitro , обусловлены дифференциальной внутренней регуляцией стволовых клеток, присутствующей в SI и LI.

Мы ограничили наше исследование клетками человека, и путем культивирования основной массы кишечных клеток на фидерном слое с экзогенным фактором Wnt, R-спондином 2, мы смогли охарактеризовать разросшиеся эпителиальные клетки по свойствам стволовых клеток, таким как самообновление и полипотенциальность, без систематической ошибки предварительный отбор клеток по определенному фенотипу. In vivo Баланс пролиферации и дифференцировки кишечного эпителия, включая нишу стволовых клеток, зависит от многих факторов Wnt [4,5,34]. Только недавно была обнаружена высокая экспрессия R-Spondin 2, который, как известно, усиливает предшественников кишечного эпителия и ограничивает дифференцировку через LGR5, обнаруженную в субэпителиальных миофибробластах кишечника [35,36]. Следовательно, зависимость от R-Spondin 2 кишечных эпителиальных клеток, размноженных фидерными клетками in vitro , согласуется с поддержанием кишечных стволовых клеток in vivo .

Ожидаемая общая экспрессия предполагаемых маркеров стволовых клеток CD133.1, CD166 и CD24 на клетках, выросших из двух сегментов кишечника, позволяет предположить, что они имеют природу стволовых клеток. Однако после анализа специфических паттернов экспрессии CD13, CD133.1 и CD66c выявились различия. Более высокая экспрессия CD13 в клетках, выросших из SI, согласуется с отчетами, показывающими, что это наиболее распространенная пептидаза в SI млекопитающих, при этом экспрессия CD13 постоянно снижается по восходящей и нисходящей LI [37,38].Кроме того, учитывая его связь с CSC толстой кишки, более высокая экспрессия CD133.1 на клетках, размноженных из LI, может указывать на предрасположенность этих клеток к неопластической трансформации по сравнению с клетками, размноженными из SI [39]. Наконец, функционально используя дифференциальный паттерн экспрессии CD66c, мы идентифицировали противоположные популяции клеток с колониеобразующей способностью. Высокая экспрессия CD66c в обогащенных стволовыми клетками культурах из LI обеспечивает повышенное самообновление и вместе с высокой экспрессией CD133.1, предполагает внутреннюю регуляторную разницу, объясняющую, почему эти стволовые клетки могут быть более восприимчивы к трансформации, чем их аналоги SI [40,41].

Кроме того, анализ массива генов продемонстрировал глобальные различия между клетками, выросшими из SI и LI. Дифференциальная экспрессия указывала на тенденцию клеток, размножающихся из LI, быть более тесно связанными с раком, чем их аналоги SI. В частности, серологически определяемый антиген 1 рака толстой кишки ( SDCCAG1 ) и ассоциированный с опухолью преобразователь сигнала кальция 2 ( TACSTD2 ) определяются по их присутствию и связи с раком.Индуцируемый гипоксией фактор 1 ( HIF1A ) участвует в ангиогенезе, готов питать любую новую опухоль, которая начинает формироваться [42]. Prom1 , также известный как CD133 , является хорошо известным маркером CSC, обсуждавшимся ранее [20]. Более высокая экспрессия белка 3, связывающего инсулиноподобный фактор роста ( IGFBP3 ), участвующего в гомеостазе кишечного эпителия, может указывать на более тонкий баланс, необходимый в LI по сравнению с SI [43]. Наконец, секретируемый фосфопротеин 1 ( SPP1 ), также известный как остеопонтин ( OPN ), был транскриптом с наибольшим кратным изменением между клетками LI и SI (в 142 раза выше в клетках LI).Экспрессия SPP1 не только выше в клеточных линиях колоректального рака, чем в нормальных клеточных линиях кишечника, но и выше в опухолевой ткани по сравнению с нормальной тканью [44,45]. Это также коррелирует с метастазированием в лимфатические узлы, лимфатической или венозной инвазией и стадией TNM (классификация злокачественных опухолей). Пациенты с более высокой экспрессией SPP1 имели более низкую 5-летнюю выживаемость, и считается, что это независимый прогностический фактор. Следовательно, он может играть роль в прогрессировании CRC и может быть прогностическим маркером для пациентов [45].Повышенная экспрессия этих молекул в клетках LI и связанные с ними молекулярные пути не только подтверждают внутренние различия между SI и LI, но, возможно, являются функциональной причиной того, почему в LI больше рака по сравнению с SI. Таким образом, различия на уровне стволовых клеток способствуют не только раздельной структуре и функции двух тканевых сегментов, но и их различному ответу на повреждения, ведущие к заболеванию.

Молекулярные различия, выявленные между клетками, выращенными из SI и LI, хорошо коррелировали с различиями в дифференцировке с использованием трехмерной системы культивирования.Фордхэм и др. al использовали аналогичные условия культивирования для роста кишечных стволовых клеток из фетального материала в гестационном возрасте десять недель [46]. Тем не менее, клетки такой ранней стадии не требовали экспансии до высокоэффективного образования органоидов из первичной ткани, но требовали дополнительных факторов для поддержания клеток. В 20-23 недели, как представлено здесь, первичная структура ткани намного более дифференцирована, имитируя взрослую организацию и требуя отбора и размножения фидерных клеток перед использованием в тестах на образование органоидов.Кроме того, в Fordham et. В другом исследовании целые эпителиальные единицы изначально были встроены в их культуры, тогда как в нашем исследовании отдельные клетки были высеяны на фидерный слой, чтобы устранить более дифференцированные клетки, присутствующие на 20–23 неделе гестационного возраста. Фидерный слой позволил нам расширить и поддерживать популяцию стволовых клеток в недифференцированном состоянии до встраивания в Matrigel. Это расширение позволило получить более гомогенную клеточную популяцию для анализа в органоидной системе без присутствия дифференцированных клеток из первичной ткани.

Первоначальное наблюдение дифференцировки в бокаловидные клетки подтвердило мультипотенциальность клеток, размножающихся как из SI, так и из LI, продемонстрировав при этом, что их внутренние различия определяют уникальный потенциал дифференцировки. Неопределяемая экспрессия ATOh2 в органоидах LI согласовывалась с данными профилирования экспрессии генов, которые показали, что клетки, размножающиеся из LI, экспрессируют ATOh2 на более низком уровне, чем клетки, размножающиеся из SI. Интересно, что ATOh2 необходим для эффективности GSI [47], что может объяснить ограниченную экспрессию белка MUC2, наблюдаемую в органоидах LI, обработанных DAPT.Предыдущие исследования показали, что 70% образцов пациентов с колоректальным раком значительно снизили экспрессию ATOh2 по сравнению с нормальными образцами LI, соответствующими тканям, и выявили ATOh2 как супрессор опухоли in vitro и in vivo [48]. Следовательно, отсутствие обнаруживаемого ATOh2 в клетках, размноженных из LI, может сделать их более восприимчивыми к трансформации, чем их аналоги SI.

Наконец, несоответствие в экспрессии связанных со стволовыми клетками генов EPHB2 , LGR5 и MYC может указывать на еще неизвестный молекулярный путь, который отличает стволовые клетки LI от стволовых клеток SI.Более высокая экспрессия LGR5 в органоидах LI может означать наличие клеток с более высокой устойчивостью к повреждениям, репарацией ДНК и преимуществами роста, которые в случае трансформации могут придавать устойчивость к раковым клеткам [49,50]. Несмотря на то, что экспрессия LGR5 остается высокой при обработке дифференцировкой в ​​культурах LI, LGR5, вероятно, остается маркером стволовых клеток как в SI, так и в LI. Lgr5 + клетки присутствуют в циклических столбчатых клетках мыши в основании крипты и могут генерировать клетки всех эпителиальных клонов кишечника, предполагая природу стволовых клеток [4].Кроме того, в качестве рецептора R-спондина 2 LGR5 может опосредовать нишу стволовых клеток [6,8]. Однако представленная здесь работа представляет новое наблюдение в клетках человека дифференциальной регуляции LGR5 при дифференцировке, что может указывать на отдельную функцию LGR5 в LI в дополнение к его присутствию в качестве маркера стволовых клеток кишечника.

Функционально LGR5 является одновременно рецептором лигандов Wnt (R-spondins) и мишенью транскрипции пути Wnt [4,6,8]. Здесь мы показываем, что мРНК LGR5 по-разному экспрессируется в клетках SI и LI, при этом LGR5 остается высоким в клетках LI после удаления факторов Wnt и даже при ингибировании γ-секретазы (фиг.6D&E). Это, по-видимому, не согласуется с параллельным увеличением бокаловидных клеток в тех же условиях в клетках LI после обработки дифференцировкой (рис. 5A-C). Известно, что сигнальные пути Wnt и Notch функционируют совместно в кишечном эпителии, кишечных стволовых клетках и развитии опухоли [1,13,14]. ATOh2, ключевой регулятор пути Notch, может быть помечен для деградации с помощью GSK3-β в присутствии сигналов Wnt и считается необходимым для формирования бокаловидных клеток и ответа на ингибирование γ-secretase [47].Здесь мы показываем, что ATOh2 не был обнаружен в клетках, полученных из LI, даже при ингибировании γ-секретазы (рис. 6B и E), что предполагает альтернативный путь в LI. Комбинированный результат высокого уровня LGR5 в сочетании с отсутствием ATOh2 в LI может указывать на возможный новый путь, потенциально включающий LGR5/Wnt и ATOh2/Notch для регуляции дифференцировки в LI.

Насколько нам известно, это первый всеобъемлющий отчет, характеризующий различия между клетками, полученными из первичных SI и LI человека.Ожидаемые результаты, полученные в результате экспериментов с образцами SI, подтверждают, что объединение расширения обогащенной популяции стволовых клеток с последующим анализом трехмерной дифференцировки воспроизводимо создает среду, подобную той, что обнаружена in vivo . Хотя есть доказательства внешней регуляции кишечных стволовых клеток [33], неожиданные результаты, наблюдаемые с образцами LI, предполагают ключевые внутренние различия между стволовыми клетками SI и LI человека. Эти различия могут объяснять повышенную распространенность рака LI по сравнению с раком SI, а также подчеркивать важные защитные механизмы, присутствующие в SI, которые можно использовать для улучшения профилактики и лечения рака LI у человека.

Методы

Заявление об этике

Эксперименты на мышах проводились в соответствии с рекомендациями Комитета по институциональному уходу и использованию животных Университета Питтсбурга, который одобрил исследование, и проводились в соответствии с рекомендациями NIH по уходу и использованию животных (разрешение № 1006567). Кишечник человеческого плода был получен через женскую больницу Маги и Банк тканей медицинских наук Университета Питтсбурга с одобрения Институционального наблюдательного совета Университета Питтсбурга (одобрение IRB №.PRO100

) после получения письменного согласия.

Подготовка фидерных ячеек

Клетки

LA7 (ATCC: CRL-2283) выращивали в среде DMEM/F12 (Mediatech, VA) с добавлением 5% FBS, 1% Pen/Strep (Mediatech, VA), 50 нМ гидрокортизона (Sigma-Aldrich, Миссури) и 5 ​​мкг/ мл инсулина (Sigma-Aldrich, Миссури). Клетки отделяли от планшета с помощью 0,25% трипсина/0,1% этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (Mediatech, VA) и подвергали γ-облучению при 17000 рад. Колбы с клеточными культурами высевали при ~300 000 клеток/см 2 для создания сливающегося монослоя фидерных клеток перед посевом клеток человека.

Выделение и культивирование клеток кишечника

Тонкий и толстый кишечник были получены от плодов человека в возрасте 19–23 недель. Кишечник разрезали продольно в HBSS, содержимое промывали, разрезали на 1-дюймовые кусочки, переносили в EBSS/1 мМ EGTA/1% HEPES (Life Technologies, NY/Sigma-Aldrich, MO/Mediatech, VA) и измельчали. Затем ткань инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. После промывки EBSS ткань трижды обрабатывали коктейлем, содержащим 1 мг/мл коллагеназы II (Life Technologies, Нью-Йорк), 1 мг/мл гиалуронидазы (Sigma-Aldrich, Миссури) и 20 мкг/мл ДНКазы I (Roche, Индиана) в HBSS/1% HEPES в течение 20 мин.Суспензию ткани/клеток пропускали через клеточный фильтр с размером ячеек 100 мкм (Fisher, PA) для выделения отдельных клеток из непереваренной ткани. Клетки высевали на облученные фидеры при ~80 000 клеток/см 2 в DMEM/F12 с добавлением 0,5% FBS, 25 мкг/мл гентамицина (Sigma-Aldrich, MO), 1% инсулин-трансферрин селена (ITS) (Mediatech, VA). ) и 0,1 нг/мл человеческого R-спондина 2 (R&D, Миннесота). При высеве отдельных клеток в среду добавляли 10 мкМ ингибитора ROCK Y-27632 (Reagents Direct, CA) на ~24 часа.Культуры пассировали через 2–3 недели после посева (~70% слияния) путем инкубации с EBSS/1 мМ EGTA/1% HEPES с последующим 0,25% трипсином/0,1% ЭДТА.

Сортировка и анализ клеток с активированной флуоресценцией

Суспензии отдельных клеток

окрашивали соответствующими антителами (таблица S3) по 200 000 клеток на пробирку и анализировали на MACSQuant (Miltenyi Biotec, Германия) или BD FACSAriaII (BD Biosciences, MA). Дискриминацию синглетов проводили, как описано Wersto et al. [51]. Анализ после приобретения был проведен в FlowJo (http://www.www.treestar.com). Индекс окрашивания рассчитывали как D/W, где D — расстояние между положительной и отрицательной популяциями, а W — два стандартных отклонения отрицательной популяции. LDA выполняли путем сортировки 1, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 клеток на лунку в соответствующие ряды 96-луночных планшетов (Corning, NY), предварительно засеянных облученными фидерными клетками. Отдельные лунки оценивали на присутствие колоний через четыре недели. Количество лунок с колониями вводили в L-Calc (Stem Cell Technologies, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада) для расчета частоты КОЕ.

Анализ дифференцировки Matrigel

Анализ дифференцировки, использованный в этом исследовании, был изменен Sato, et al. [19]. Вкратце, размноженные кишечные клетки суспендировали в 50 мкл матригеля со сниженным фактором роста (GFR), не содержащего фенолового красного (BD Bioscience, CA), и высевали в чашки для тканевых культур с низкой плотностью (~50 000 клеток/лунка 48-луночного планшета). После затвердевания при 37°C в течение 30 мин матригель покрыли средой стволовых клеток (SC) (таблица S4). В течение первых 24 часов СМИ включали Y-27632, чтобы предотвратить аноики.После первоначального посева в среду SC и образования небольших органоидов две трети лунок переключали на среду для дифференциации (Diff), чтобы обеспечить возможность дифференциации органоидов. После дальнейшего роста органоидов в половину лунок, содержащих среду Diff, добавляли ингибитор γ-секретазы DAPT (Reagents Direct, CA) в концентрации 10 мкмоль/мл на три дня. Среду меняли во всех лунках три раза в неделю. Полученные органоиды выделяли с использованием 0,2% диспазы (Life Technologies, Нью-Йорк), 0,1% коллагеназы II и 20 мкг/мл ДНКазы I.Затем органоиды промывали в PBS (Mediatech, VA) для последующего применения.

Анализ экспрессии мРНК

Тотальную РНК экстрагировали из замороженных клеточных осадков размноженных клеток плода человека из SI или LI (SI; n = 6 и LI; n = 6) в диапазоне от 2–8 пассажей на фидерных клетках. Данные экспрессии (значение q<0,05, двукратное изменение) импортировали в программное обеспечение Ingenuity (Ingenuity Pathways Analysis, Ingenuity Systems Inc, CA) для анализа путей. Все рисунки построены с использованием незарегистрированных данных для сохранения исходного биологического распределения экспрессии.См. Методы S1 для более подробной информации.

Дополнительная информация

S1 Рис. Изображение пути Notch.

Лиганд Notch, Delta/Serrate/LAG-2 (DSL), одной клетки активирует рецептор Notch соседней клетки. Внутриклеточный домен Notch (NICD) расщепляется гамма-секретазой (GS) и активирует Hes1. Hes1 блокирует активацию Muc2 посредством блокирования ATOh2, и клетка сохраняет состояние предшественника. В клетке, где Notch неактивен, ATOh2 активирует MUC2, и клетка принимает судьбу бокаловидной клетки.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0118792.s001

(TIF)

S2 Рис. ПЦР в реальном времени, подтверждающая анализ массива генов.

Выбранные гены были проанализированы с использованием ПЦР в реальном времени для подтверждения результатов набора генов. РНК из клеток, выращенных из трех парных образцов SI и LI (1, 2 и 3), анализировали на экспрессию шести генов, идентифицированных как дифференциально экспрессируемые при анализе массива генов. В 6/6 случаях ПЦР-анализ в реальном времени подтвердил тот же паттерн экспрессии, что и анализ массива генов.Значения SI использовались в качестве контроля и в каждом случае были установлены на 1. Значения выражения LI относятся к выражению SI. SI 1 и 3 не имели обнаруживаемой экспрессии SPP1 , поэтому SI2 использовали для расчета кратного изменения в LI 1, 2 и 3. Экспрессию нормализовали до мРНК GAPDH . Изменения сгиба представлены над полосами для пояснения. Столбики погрешностей представляют верхний и нижний пределы ошибок, основанные на повторной изменчивости. Все сравнения экспрессии между клетками SI и LI были значимыми ( P <0.05). (n = 3 лунки на пару образец/праймер).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0118792.s002

(TIF)

S3 Рис. Отслеживание роста органоидов из одной клетки.

Органоиды SI или LI, выращенные в среде SC, среде для дифференцировки (Diff) и среде Diff с добавлением DAPT в течение последних трех дней, с последующим переходом от одиночной клетки к многоклеточным органоидам. Стрелки и наконечники указывают на рост органоидов из одной клетки. Масштабная линейка = 50 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0118792.s003

(TIF)

S4 Рис. Энтероэндокринные клетки обнаруживаются чаще в SI по сравнению с LI

in vivo .

( A ) SI нормального плода человека (слева) и LI (справа), окрашенные на эпителиальный маркер EPCAM (зеленый) и энтероэндокринный маркер CHGA (красный). Контрастное окрашивание, Hoechst 33342. Масштабная линейка = 50 мкм. ( B ) Клетки подсчитывали как количество клеток на крипту и изображали на гистограмме (* P <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0118792.s004

(TIF)

S5 Рис. Дифференциальная экспрессия виллина в кишечных органоидах.

Органоиды SI (слева) и LI (справа), выращенные в среде SC, среде для дифференцировки (Diff) и среде Diff с добавлением DAPT, окрашенного на маркер энтероцитов Villin (VIL1) (красный). Контрастное окрашивание, Hoechst 33342. Масштабная линейка = 50 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0118792.s005

(TIF)

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить г-жу.Christin Sciulli за ее технические знания в области обработки и обработки генных массивов, а также Lynda Guzik из Центра проточной цитометрии McGowan Institute за ее технические знания в области FACS.

Авторские взносы

Идея и разработка экспериментов: JMC AG WL EL. Выполняли эксперименты: JMC TT AG. Проанализированы данные: JMC TT AG WL EL. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты для анализа: JMC WL EL. Написал статью: JMC AG WL EL.

Каталожные номера

  1. 1.Fre S, Huyghe M, Mourikis P, Robine S, Louvard D, Artavanis-Tsakonas S. Сигналы Notch контролируют судьбу незрелых клеток-предшественников в кишечнике. Природа. 2005; 435: 964–968. пмид:15959516
  2. 2. Пинто Д., Клеверс Х. Контроль Wnt стволовых клеток и их дифференцировка в кишечном эпителии. Разрешение ячейки опыта. 2005; 306: 357–363. пмид:152
  3. 3. Хауладер Н.А., Крапчо М., Гаршелл Дж., Нейман Н., Альтекрусе С.Ф., Косари С.Л., Ю М., Рул Дж., Таталович З., Чо Х., Мариотто А., Льюис Д.Р., Чен Х.С., Фойер Э.Дж., Кронин К.А. (ред.).Обзор статистики рака SEER, 1975–2010 гг. Национальный институт рака Бетесда, Мэриленд. на основе данных SEER за ноябрь 2012 г., размещенных на веб-сайте SEER, 2013 г.
  4. 4. Баркер Н., ван Эс Дж. Х., Куйперс Дж., Куджала П., ван ден Борн М., Козийнсен М. и др. Идентификация стволовых клеток тонкой и толстой кишки по маркерному гену Lgr5. Природа. 2007; 449: 1003–1007. пмид:17934449
  5. 5. Сато Т., Врис Р.Г., Снипперт Х.Дж., ван де Ветеринг М., Баркер Н., Штанге Д.Э. и другие. Отдельные стволовые клетки Lgr5 строят структуры крипт-ворсинок in vitro без мезенхимальной ниши.Природа. 2009; 459: 262–265. пмид:19329995
  6. 6. Шуйерс Дж., Клеверс Х. Стволовые клетки взрослых млекопитающих: роль Wnt, Lgr5 и R-спондинов. EMBO J. 2012; 31: 2685–2696. пмид:22617424
  7. 7. Коринек В., Баркер Н., Мёрер П., ван Донселаар Э., Халс Г., Петерс П.Дж. и др. Истощение компартментов эпителиальных стволовых клеток в тонком кишечнике мышей, лишенных Tcf-4. Нат Жене. 1998; 19: 379–383. пмид:9697701
  8. 8. де Лау В., Баркер Н., Лоу Т.И., Коо Б.К., Ли В.С., Теуниссен Х. и др.Гомологи Lgr5 связываются с рецепторами Wnt и опосредуют передачу сигналов R-spondin. Природа. 2011; 476: 293–297. пмид:21727895
  9. 9. Пауэлл С.М., Зилз Н., Бизер-Барклай Ю., Брайан Т.М., Гамильтон С.Р., Тибодо С.Н. и др. Мутации APC возникают на ранних стадиях колоректального онкогенеза. Природа. 1992; 359: 235–237. пмид:1528264
  10. 10. Морин П.Дж., Спаркс А.Б., Коринек В., Баркер Н., Клеверс Х., Фогельштейн Б. и соавт. Активация передачи сигналов бета-катенин-Tcf при раке толстой кишки за счет мутаций в бета-катенине или APC.Наука. 1997; 275: 1787–1790. пмид:

    02

  11. 11. Баркер Н., Риджуэй Р.А., ван Эс Дж.Х., ван де Ветеринг М., Бегтель Х., ван ден Борн М. и др. Криптовые стволовые клетки как клетки-источники рака кишечника. Природа. 2009; 457: 608–611. пмид:1

    04

  12. 12. Schepers AG, Snippert HJ, Stange DE, van den Born M, van Es JH, van de Wetering M, et al. Отслеживание клонов выявляет активность стволовых клеток Lgr5+ в кишечных аденомах мышей. Наука. 2012; 337: 730–735. пмид:22855427
  13. 13.Fre S, Pallavi SK, Huyghe M, Lae M, Janssen KP, Robine S, et al. Сигналы Notch и Wnt совместно контролируют пролиферацию клеток и онкогенез в кишечнике. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009; 106: 6309–6314. пмид:1

    39

  14. 14. Казанджян А, Шройер НФ. Передача сигналов NOTCH и ATOh2 при колоректальном раке. Curr Colorectal Cancer Rep. 2011;7: 121–127. пмид:21980310
  15. 15. Сикандар С.С., Пейт К.Т., Андерсон С., Дизон Д., Эдвардс Р.А., Уотерман М.Л. и соавт.Передача сигналов NOTCH необходима для образования и самообновления клеток, инициирующих опухоль, и для подавления дифференцировки секреторных клеток при раке толстой кишки. Рак рез. 2010; 70: 1469–1478. пмид:20145124
  16. 16. ван Эс Дж. Х., ван Гейн М. Е., Риччио О., ван ден Борн М., Воийс М., Бегтель Х. и др. Ингибирование Notch/гамма-секретазы превращает пролиферативные клетки кишечных крипт и аденом в бокаловидные клетки. Природа. 2005; 435: 959–963. пмид:15959515
  17. 17. Эманн Великобритания, Петерсон В.Д. мл., Мисфельд ДС. Для выращивания эпителиальных клеток молочной железы мышей в культуре. Джей Селл Биол. 1984; 98: 1026–1032. пмид:6699079
  18. 18. Odoux C, Fohrer H, Hoppo T, Guzik L, Stolz DB, Lewis DW, et al. Стохастическая модель происхождения раковых стволовых клеток при метастатическом раке толстой кишки. Рак рез. 2008; 68: 6932–6941. пмид:18757407
  19. 19. Сато Т., Станге Д.Э., Ферранте М., Врис Р.Г., Ван Эс Дж.Х., Ван ден Бринк С. и др. Долгосрочное распространение эпителиальных органоидов из толстой кишки человека, аденомы, аденокарциномы и эпителия Барретта.Гастроэнтерология. 2011; 141: 1762–1772. пмид:21889923
  20. 20. Кемпер К., М.Р. Сприк, М. де Бри, А. Скопеллити, Л. Вермеулен, М. Хук и др. Эпитоп AC133, но не белок CD133, теряется при дифференцировке раковых стволовых клеток. Рак рез. 2010; 70: 719–729. пмид:20068153
  21. 21. О’Брайен К.А., Поллетт А., Гэллинджер С., Дик Дж.Е. Раковая клетка толстой кишки человека способна инициировать рост опухоли у иммунодефицитных мышей. Природа. 2007; 445: 106–110. пмид:17122772
  22. 22.Риччи-Витиани Л., Ломбарди Д.Г., Пилоцци Э., Биффони М., Тодаро М., Пешле С. и соавт. Идентификация и размножение клеток, инициирующих рак толстой кишки человека. Природа. 2007; 445: 111–115. пмид:17122771
  23. 23. Инь А.Х., Миралья С., Занджани Э.Д., Алмейда-Порада Г., Огава М., Лири А.Г. и др. AC133, новый маркер гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников человека. Кровь. 1997; 90: 5002–5012. пмид:9389720
  24. 24. Учида Н., Бак Д.В., Хе Д., Рейтсма М.Дж., Масек М., Фан Т.В. и др.Прямая изоляция стволовых клеток центральной нервной системы человека. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000; 97: 14720–14725. пмид:11121071
  25. 25. Левин Т.Г., Пауэлл А.Е., Дэвис П.С., Силк А.Д., Дисмьюк А.Д., Андерсон Е.К., и соавт. Характеристика маркера стволовых клеток рака кишечника CD166 в желудочно-кишечном тракте человека и мыши. Гастроэнтерология. 2010; 139: 2072–2082 e2075. пмид:20826154
  26. 26. фон Фюрстенберг Р.Дж., Гулати А.С., Бакси А., Доэрти Дж.М., Стаппенбек Т.С., Грац А.Д. и соавт.Сортировка эпителиальных клеток тощей кишки мыши с помощью CD24 дает популяцию с характеристиками кишечных стволовых клеток. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2011; 300: G409–417. пмид:21183658
  27. 27. Wang F, Scoville D, He XC, Mahe MM, Box A, Perry JM и др. Выделение и характеристика стволовых клеток кишечника на основе комбинаций поверхностных маркеров и анализа образования колоний. Гастроэнтерология. 2013; 145: 383–395 e381–321. пмид:23644405
  28. 28. Ментлин Р.Пептидазы клеточной поверхности. Int Rev Cytol. 2004; 235: 165–213. пмид:15219783
  29. 29. Weilbaecher K, Weissman I, Blume K, Heimfeld S. Культура фенотипически определенных гемопоэтических стволовых клеток и других клеток-предшественников при предельном разведении на монослоях Dexter. Кровь. 1991; 78: 945–952. пмид:1678290
  30. 30. Waldmann H, Lefkovits I, Quintans J. Анализ предельного разведения функции Т-хелперов. Иммунология. 1975; 28: 1135–1148. пмид:1079511
  31. 31. Инь X, Фарин Х.Ф., ван Эс Дж.Х., Клеверс Х., Лангер Р., Карп Дж.М.Нишево-независимые высокочистые культуры Lgr5+ интестинальных стволовых клеток и их потомства. Нат Методы. 2014; 11: 106–112. пмид:242

  32. 32. Юнг П., Сато Т., Мерлос-Суарес А., Баррига Ф.М., Иглесиас М., Росселл Д. и др. Выделение и размножение in vitro стволовых клеток толстой кишки человека. Нат Мед. 2011;17: 1225–1227. пмид:218
  33. 33. Medema JP, Vermeulen L. Микроокружающая регуляция стволовых клеток в кишечном гомеостазе и раке. Природа. 2011; 474: 318–326.пмид:21677748
  34. 34. Scoville DH, Sato T, He XC, Li L. Современный взгляд: стволовые клетки кишечника и передача сигналов. Гастроэнтерология. 2008; 134: 849–864. пмид:18325394
  35. 35. Лей Н.Ю., Джабаджи З., Ван Дж., Джоши В.С., Бринкли Г.Дж., Халил Х. и др. Кишечные субэпителиальные миофибробласты поддерживают рост кишечных эпителиальных стволовых клеток. ПЛОС Один. 2014;9: e84651. пмид:24400106
  36. 36. Папапьетро О., Театро С., Танабаласуриар А., Юки К.Е., Диез Э., Чжу Л. и др.Передача сигналов R-spondin 2 опосредует восприимчивость к фатальной инфекционной диарее. Нац коммун. 2013;4: 1898. pmid:23695692
  37. 37. Риманн Д., Келен А., Лангнер Дж. CD13 — не просто маркер при типировании лейкемии. Иммунол сегодня. 1999; 20: 83–88. пмид:10098327
  38. 38. Глебов О.К., Родригес Л.М., Накахара К., Дженкинс Дж., Клиатт Дж., Хамберд С.Дж. и др. Различение правого и левого отделов толстой кишки по характеру экспрессии генов. Эпидемиологические биомаркеры рака Prev. 2003; 12: 755–762. пмид:12

    7

  39. 39.Zhu L, Gibson P, Currle DS, Tong Y, Richardson RJ, Bayazitov IT, et al. Проминин 1 маркирует стволовые клетки кишечника, которые подвержены неопластической трансформации. Природа. 2009; 457: 603–607. пмид:1

    05

  40. 40. Гемей М., Мирабелли П., Ди Ното Р., Корбо С., Яккарино А., Замболи А. и др. CD66c является новым маркером для выделения стволовых клеток колоректального рака, и его подавление останавливает рост опухоли in vivo. Рак. 2012.
  41. 41. Чан Ч., Кук Д., Станнерс К.П.Повышенная восприимчивость к опухолям толстой кишки у трансгенных мышей CEABAC, получавших азоксиметан. Канцерогенез. 2006; 27: 1909–1916. пмид:16632476
  42. 42. Кинтеро М., Маккензи Н., Бреннан П.А. Индуцируемый гипоксией фактор 1 (HIF-1) при раке. Eur J Surg Oncol. 2004; 30: 465–468. пмид:15135470
  43. 43. Модика С., Моргано А., Сальваторе Л., Петруцелли М., Ванье М.Т., Валанцано Р. и др. Экспрессия и локализация субстрата инсулинового рецептора 2 в нормальном кишечнике и колоректальных опухолях.Регуляция специфичным для кишечника фактором транскрипции CDX2. Кишка. 2009; 58: 1250–1259. пмид:108
  44. 44. Huang J, Pan C, Hu H, Zheng S, Ding L. Остеопонтин-усиленные метастазы в печень клеток колоректального рака. ПЛОС Один. 2012;7: e47901. пмид:23112867
  45. 45. Likui W, Hong W, Shuwen Z. Клиническое значение повышенной экспрессии мРНК остеопонтина при колоректальном раке человека. J Gastrointest Surg. 2010; 14: 74–81. пмид:19763701
  46. 46.Fordham RP, Yui S, Hannan NR, Soendergaard C, Madgwick A, Schweiger PJ, et al. Трансплантация расширенных кишечных предшественников плода способствует регенерации толстой кишки после повреждения. Клеточная стволовая клетка. 2013; 13: 734–744. пмид:24139758
  47. 47. Казанджян А., Ной Т., Браун Д., Беркарт Дж., Шройер Н.Ф. Атональный гомолог 1 необходим для эффектов роста и дифференцировки ингибиторов Notch/гамма-секретазы на нормальные и раковые эпителиальные клетки кишечника. Гастроэнтерология.2010; 139: 918–928, 928 e911–916. пмид:20621629
  48. 48. Боссайт В., Казанджян А., Де Гест Н., Ван Келст С., Де Хертог Г., Гебоэс К. и др. Атональный гомолог 1 представляет собой ген-супрессор опухоли. PLoS биол. 2009;7: е39. пмид:1

    19

  49. 49. Francipane MG, Chandler J, Lagasse E. Раковые стволовые клетки: движущаяся мишень. Curr Pathobiol Rep. 2013; 1: 111–118. пмид:23

    1
  50. 50. Hsu HC, Liu YS, Tseng KC, Hsu CL, Liang Y, Yang TS, et al. Сверхэкспрессия Lgr5 коррелирует с резистентностью к химиотерапии на основе 5-ФУ при колоректальном раке.Int J Colorectal Dis. 2013; 28: 1535–1546. пмид:23784051
  51. 51. Версто Р.П., Хрест Ф.Дж., Лири Дж.Ф., Моррис С., Стетлер-Стивенсон М.А., Габриэльсон Э. Дискриминация дублетов в анализе клеточного цикла ДНК. Цитометрия. 2001; 46: 296–306. пмид:11746105

Работа над первым искусственным кишечником

Судьбоносная встреча с недоношенным ребенком вдохновила Дэвида Хэкэма на создание искусственного кишечника.

Хакам, который в сентябре стал главным детским хирургом Детского центра Джонса Хопкинса, в то время был лечащим хирургом в Детской больнице Питтсбурга, который оплачивал хирургическую помощь в местной больнице.Этому младенцу, о котором он заботился, внезапно стало хуже: он заболел кишечным расстройством, называемым некротизирующим энтероколитом (НЭК), в критическом состоянии. Характеризующийся быстрой и необратимой гибелью кишечной ткани, НЭК встречается у 12% недоношенных детей. Это одно из самых трудно поддающихся лечению состояний; единственным методом лечения является хирургическое иссечение отмирающих участков кишечника.

Хэкэм сблизился с родителями малыша. Некоторое время младенец чувствовал себя достаточно хорошо, но в конце концов умер, ожидая трансплантации печени.Опыт был отрезвляющим.

Операция по поводу НЭК, хотя и спасает жизни, но приводит к синдрому короткой кишки у детей, переживших это заболевание. В этом случае дети не могут усваивать пищу и нуждаются в кормовой поддержке на протяжении всей жизни, что подвергает их риску токсичности печени и рецидивирующих инфекций. По его словам, многим требуется трансплантация, но донорскую ткань трудно найти, а иммуносупрессивная терапия после трансплантации сопряжена с долгосрочными проблемами и рисками.

С 5000 детей, страдающих от синдрома короткой кишки по всей стране, «искусственная кишка — это следующая важная цель в современной медицине, которая должна быть достигнута», — говорит он.

Хакам и Джон Марч, инженер-биомедик из Корнелла, добились успеха в создании искусственного кишечника, выращенного путем взятия стволовых клеток кишечника и выращивания их на трехмерных каркасах, изготовленных из биоразлагаемых синтетических материалов. Работа «создала структуру, которая имеет поразительное сходство с нормальным кишечником», — говорит Хакам, включая тонкие, похожие на пальцы выступы человеческого кишечника, называемые микроворсинками, которые поглощают питательные вещества. Они успешно имплантировали модель мышам и собакам и теперь оценивают, насколько хорошо она будет поглощать питательные вещества.

Хэкэм привел команду из шести ученых со своего предыдущего поста в Университете Питтсбурга. По его словам, сотрудничая с экспертами Университета Джона Хопкинса в области микробиологии, биомедицинской инженерии, тканевой инженерии и биологии стволовых клеток, он надеется ускорить темпы исследований и получить прототип для испытаний на людях в течение пяти лет.

Услуги медицинского консьержа Johns Hopkins предлагают бесплатную помощь в назначении визитов и планировании поездок.Запросить бесплатную помощь:

Все поля обязательны *

Коронавирус SARS-CoV-2 заражает клетки кишечника вызывает COVID-19, может поражать клетки кишечника и там размножаться.Используя современные модели клеточных культур кишечника человека, исследователи успешно размножили вирус in vitro и отслеживали реакцию клеток на вирус, предоставив новую модель клеточной культуры для изучения COVID-19. . Эти результаты могут объяснить наблюдение, что примерно у трети пациентов с COVID-19 наблюдаются желудочно-кишечные симптомы, такие как диарея, а также тот факт, что вирус часто можно обнаружить в образцах стула.

Результаты этого исследования были опубликованы в научном журнале Science 1 мая 2020 года.

У пациентов с COVID-19 проявляются различные симптомы, связанные с органами дыхания, такие как кашель, чихание, одышка и лихорадка, и болезнь передается через крошечные капли, которые распространяются в основном при кашле и чихании. Однако у трети пациентов также отмечаются желудочно-кишечные симптомы, такие как тошнота и диарея. Кроме того, вирус можно обнаружить в стуле человека спустя много времени после исчезновения респираторных симптомов. Это говорит о том, что вирус также может распространяться путем так называемой «фекально-оральной передачи».»

Несмотря на то, что органы дыхания и желудочно-кишечный тракт могут показаться очень разными, есть некоторые ключевые сходства. Особенно интересным сходством является наличие рецептора ACE2, через который вирус COVID-19, вызывающий SARS-CoV-2, может проникать в клетки. Внутренняя часть кишечника загружена рецепторами ACE2. Однако до сих пор было неизвестно, действительно ли кишечные клетки могут инфицироваться и производить вирусные частицы.

Кишечные органоиды

Исследователи из Института Хабрехта, Университета Эразма и Маастрихтского университета решили определить, может ли вирус SARS-CoV-2 напрямую инфицировать клетки кишечника, и если да, то может ли он там также размножаться.Они использовали кишечные органоиды человека: крошечные версии человеческого кишечника, которые можно выращивать в лаборатории. Ганс Клеверс (Институт Хабрехта): «Эти органоиды содержат клетки слизистой оболочки кишечника человека, что делает их убедительной моделью для исследования инфекции SARS-CoV-2».

Инфекция кишечных клеток

Когда исследователи добавили вирус к органоидам, они быстро заразились. Вирус проникает в подмножество клеток кишечных органоидов, и количество инфицированных клеток со временем увеличивается.Используя электронную микроскопию, передовой способ визуализации различных компонентов клетки в мельчайших деталях, исследователи обнаружили вирусные частицы внутри и снаружи клеток органоидов. Питер Петерс (Маастрихтский университет): «Из-за карантина мы все изучали виртуальные препараты инфицированных органоидов удаленно из дома».

Исследователи изучили реакцию клеток кишечника на вирус с помощью секвенирования РНК — метода изучения того, какие гены активны в клетках. Это показало, что активируются так называемые гены, стимулированные интерфероном.Известно, что эти гены борются с вирусной инфекцией. Будущая работа будет сосредоточена на этих генах более тщательно и на том, как их можно использовать для разработки новых методов лечения.

Исследователи также культивировали органоиды в различных условиях, в результате чего получаются клетки с более высоким и более низким уровнем рецептора ACE2, через который SARS-CoV-2 может проникать в клетки. К своему удивлению, они обнаружили, что вирус инфицировал клетки как с высоким, так и с низким уровнем рецептора ACE2. В конечном итоге эти исследования могут привести к новым способам блокирования проникновения вируса в наши клетки.

Последствия

Барт Хаагманс (Erasmus MC): «Наблюдения, сделанные в этом исследовании, дают определенное доказательство того, что SARS-CoV-2 может размножаться в клетках желудочно-кишечного тракта. Однако мы пока не знаем, присутствует ли SARS-CoV-2 в клетках желудочно-кишечного тракта. кишечник пациентов с COVID-19, играет значительную роль в передаче. Наши результаты показывают, что мы должны более внимательно изучить эту возможность». Текущее исследование согласуется с другими недавними исследованиями, в которых были выявлены желудочно-кишечные симптомы у значительной части пациентов с COVID-19 и вирус в стуле пациентов без респираторных симптомов.Особое внимание может потребоваться пациентам с желудочно-кишечными симптомами. Таким образом, может потребоваться более обширное тестирование с использованием не только мазков из носа и горла, но также ректальных мазков или образцов стула.

Тем временем исследователи продолжают сотрудничество, чтобы больше узнать о COVID-19. Они изучают различия между инфекциями в легких и кишечнике, сравнивая органоиды легких и кишечника, инфицированные SARS-CoV-2.

Источник истории:

Материалы предоставлены Hubrecht Institute . Примечание. Содержимое можно редактировать по стилю и длине.

Роботизированная тонкая кишка? Исследователи делают один | CU Boulder Today

Приближается день, когда врачи-стажеры смогут совершенствовать определенные медицинские практики на роботизированной тонкой кишке и тестировать лечение на искусственных устройствах по сравнению с животными.

Доцент машиностроения Марк Рентшлер (крайний справа) с аспирантами (слева направо) Леви Пирсоном, Грегом Формозой и Кристин Калахан с увеличенной версией синтетической толстой кишки, созданной в рамках старшего дизайнерского проекта.Рентшлер — ведущий ученый в проекте CU Boulder по разработке сложной роботизированной тонкой кишки. (Фото Патрика Кэмпбелла)

Доцент машиностроения Марк Рентшлер возглавляет усилия по разработке искусственной роботизированной тонкой кишки для использования в медицинских лабораториях. Исследование поддерживается грантом в размере 1,25 миллиона долларов от Национального научного фонда.

Хотя тонкую кишку часто представляют просто как длинный виток розовой трубки внутри брюшной полости, на самом деле все гораздо сложнее.Он состоит из «гладких мышц», типа мышц, которые функционируют в организме автоматически. Подумайте о своем пищеводе: при глотании пищи множество гладких мышц расширяются и сокращаются одна за другой, чтобы продвигать пищу изо рта в желудок. Тонкий кишечник работает аналогичным образом, медленно продвигая пищу и питательные вещества через пищеварительный тракт.

«Наша цель — создать нечто, функционирующее одинаково, где у нас есть трубка из синтетических мышц, которые могут чувствовать друг друга, поэтому, когда одна мышца сокращается, соседняя с ней мышца может чувствовать это изменение и знать, что ей нужно сокращаться следующей, — говорит Рентшлер.

Идея роботизированной тонкой кишки может показаться странной, поскольку роботизированные устройства часто представляются жесткими и жесткими. Однако Рентшлер и междисциплинарная группа исследователей CU Boulder, в том числе доцент кафедры машиностроения Кристоф Кеплингер, бросают вызов этому восприятию.

Что нужно знать

  • Новое устройство имеет значение для лечения болезней, улучшения медицинской подготовки.
  • Мягкий, гибкий материал имеет датчики, расширяется и сжимается по требованию.
  • Устройство может ускорить биомедицинские исследования и сократить количество испытаний на животных.

«Люди обычно представляют роботов металлическими и неуклюжими, но сейчас мы разрабатываем более мягкие материалы и растяжимые электронные схемы», — говорит Кеплингер.

Команда воспользуется новой технологией робототехники, созданной Кеплингером с использованием гибкого резиноподобного материала, покрытого датчиками. Он также может расширяться и сжиматься по требованию.

Помимо Рентшлера и Кеплингера, в исследовательскую группу входят доцент компьютерных наук Николаус Коррелл, доцент машиностроения Дж.Шон Гумберт и ряд аспирантов и студентов.

В конечном счете, Рентшлер рассматривает искусственную тонкую кишку как инструмент для ускорения медицинских исследований и оценки новых устройств и методов лечения колоноскопии и скрининга колоректального рака, а также для сокращения использования испытаний на животных.

«В настоящее время такие работы часто выполняются со свиньями, но их размеры явно не такие, как у людей, и у них есть некоторые анатомические отличия, — говорит Рентшлер. человеческая реакция может помочь продвинуться дальше испытаний на животных и быстрее добраться до пациентов.»

Это также было бы хорошим учебным пособием. В то время как многие колоноскопии выполняются гастроэнтерологами, они также проводятся общими хирургами и даже врачами первичной медико-санитарной помощи. Эта система предложит врачам новый способ отточить свои навыки перед лечением пациентов.

«Возможность разработать высококачественную симуляцию очень привлекательна, — говорит Рентшлер. «Он будет предлагать всевозможные варианты, которых в настоящее время не существует».

Тонкий кишечник | Биониндзя

Квалификация:

• Идентификация слоев ткани в поперечных срезах тонкой кишки под микроскопом или на микрофотографии

   

    
Кишечник человека предназначен для всасывания продуктов пищеварения и имеет специальные структуры для выполнения этой функции

  • Тонкий кишечник всасывает полезные пищевые вещества (т.е. питательные вещества (моносахариды, аминокислоты, жирные кислоты, витамины и др.)
  • Толстая кишка всасывает воду и растворенные минералы (т.е. ионы) из неперевариваемых остатков пищи


Структура тонкой кишки

Тонкая кишка состоит из четырех основных тканевых слоев, которые (снаружи к центру):

  • Серозная оболочка – защитная наружная оболочка, состоящая из слоя клеток, укрепленных волокнистой соединительной тканью
  • Мышечный слой – наружный слой продольной мышцы (перистальтика) и внутренний слой круговой мышцы (сегментация)
  • Подслизистая оболочка – состоит из соединительной ткани, отделяющей мышечный слой от самой внутренней слизистой оболочки просвет кишки


Ниже представлено поперечное сечение подвздошной кишки – конечный отдел тонкой кишки (нажмите на изображение для просмотра цветных слоев):

Понимание:

•  Ворсинки увеличивают площадь поверхности эпителия, по которой осуществляется всасывание

•  Ворсинки поглощают мономеры, образующиеся при пищеварении, а также минеральные ионы и витамины

    
Внутренняя эпителиальная выстилка кишечника сильно сложена в виде пальцевидных выростов, называемых ворсинками (в единственном числе: ворсинки)

  • Многие ворсинки выпячиваются в просвет кишечника, значительно увеличивая доступную площадь поверхности для всасывания материала

Особенности Вилли

Кишечные ворсинки содержат несколько ключевых элементов, облегчающих всасывание продуктов пищеварения (мономеров, ионов и витаминов):

  • M ICROVILLI — Ruffling эпителиальной мембраны дополнительно увеличивает площадь поверхности
  • R
  • R ICH кровоснабжение — плотная капиллярная сеть быстро транспортирует поглощенные продукты
  • S Эпителий условного слоя — минимизирует диффузионное расстояние между Люмена и кровь
  • L Acteals — поглощает липиды из кишечника в лимфатическую систему
  • I
  • I Ntestinal Glands — экзокринные ямы (склепы Либеркуна) выпуска пищеварительных соков
  • м – Облегчает транспорт переваренных материалов в эпителиальные клетки


Мнемоника: MR SLIM

Особенности кишечных ворсинок

Структура эпителия ворсинок

Эпителиальная выстилка ворсинок имеет несколько структурных особенностей, которые оптимизируют ее способность абсорбировать переваренные материалы: барьер

  • Они отделяют пищеварительную жидкость от тканей и поддерживают градиент концентрации, обеспечивая одностороннее движение

  • Микроворсинки

    • Границы микроворсинок значительно увеличивают площадь поверхности плазматической мембраны (>100×), позволяя больше происходит всасывание
    • Мембрана будет встроена с иммобилизованными пищеварительными ферментами и белками каналов, чтобы помочь в поглощении материала спортивные механизмы
    • АТФ может потребоваться для первичного активного транспорта (против градиента), вторичного активного транспорта (котранспорта) или пиноцитоза


    специфическое поглощение жидкости и растворенных веществ (быстрый способ перемещения в большом количестве)

  • Эти материалы будут поглощаться путем разрыва и преобразования мембраны и, следовательно, будут содержаться в пузырьке
  • Поперечное сечение эпителия ворсинок

    .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.