Лучшее средство от дисбактериоза от антибиотиков: Пробиотики при антибиотиках — советы врачей

Содержание

Препараты от дисбактериоза. Лечение дисбактериоза кишечника народными средствами

Наверняка каждый человек в жизни хотя бы раз сталкивался с такой проблемой, как дисбактериоз. Вызвать такое нарушение может неправильное питание, употребление антибиотиков, перенесенные операции, различные заболевания, которые ослабляют нашу природную защиту. Полезные бактерии в микрофлоре погибают, и кишечник перестает правильно функционировать. Происходят сбои в переваривании и усваивании пищи. Человек может страдать от ослабленного иммунитета, частых запоров или, наоборот, от неконтролируемой диареи. Поэтому так важно вовремя начать адекватное лечение, используя лучшие препараты от дисбактериоза.

Что лечить

Важно отметить, что появление патогенных бактерий в кишечнике вызывает не сам дисбактериоз, а основное заболевание, которое протекает в организме. То есть речь пойдет об устранении первопричины нарушения. Если игнорировать и не лечить хворь, которая вызвала нарушение микрофлоры, дальнейшие попытки избавиться от бактерий станут тщетными. Дизентерия, хронический стресс, язвенная болезнь желудка, прием антибиотиков, нерациональное питание – все эти недуги приводят к условному нарушению микрофлоры. Однако при легкой степени дисбаланса бактерий достаточно будет купировать заболевание и принимать препараты для лечения дисбактериоза. Сочетание этих двух мероприятий быстро вернут флору кишечника в нормальное состояние.

Диета помогает

Очень важно не только принимать средства, чтобы победить патогенные бактерии, необходимо соблюдать правильную диету. Для нормального функционирования кишечника человеку необходимы пищевые волокна и пектин. Эти вещества в больших количествах присутствуют во фруктах, овощах, злаковых, водорослях. Отличным средством для поддержания здоровой микрофлоры станет соевое молоко. Оно содержит полезные аминокислоты: глютамин, аргинин.

Не стоит забывать и о естественных бифидо- и лактобактериях: натуральный йогурт (без сахара), творог, кефир. Необходимо употреблять продукты, которые не перевариваются нашим кишечником, но зато они способны питать естественную среду и формировать ее облигатную флору. Называются такие вещества пребиотиками. К ним относятся олигосахариды, лактулоза, фруктоза, галактоза. Чеснок, лук, молочные продукты, цикорий – популярные народные средства от дисбактериоза, которые богаты пребиотиками.

Какие средства бывают

Для профилактики и восстановления здоровой микрофлоры кишечника используют препараты от дисбактериоза. Все эти лекарственные средства можно разделить на две группы:

  1. Пробиотики. Содержат в своем составе бактерии, которые способны подавлять рост, размножение болезнетворных микробов.
  2. Пребиотики – специальные субстраты, которые создают «правильную» среду для размножения и роста полезной микрофлоры кишечника.

В свою очередь, каждый вид веществ подразделяется на группы, в зависимости от состава препарата.

Пробиотики – основа лактобактерии

Эта группа лекарственных средств выпускается в виде таблеток и порошков. Самыми популярными из них считаются средства «Ацилак» и «Биобактон», представленные в порошке. Таблетки «Лактобактерин» также эффективны при лечении нарушения микрофлоры. Существуют и ректальные свечи «Ацилакт». Такая форма приобрела популярность, благодаря способности не уничтожать полезные бактерии в кишечнике.

Данные препараты от дисбактериоза можно применять во время лечения антибиотиками. Однако все эти средства являются монопрепаратами, что не позволяет им комплексно справиться с восстановлением микрофлоры кишечника. То есть при сложном течении дисбактериоза они не смогут помочь.

Пробиотики на основе бифидобактерий

Этот вид лекарственных препаратов можно назвать самым старым в своем роде. Однако их существует огромное количество. Эффективны таблетки «Бифидумбактерин форте», порошок «Профибор», но эти медикаменты нельзя совмещать с приемом антибиотиков. Их назначают только после купирования основного заболевания. Также выпускаются ректальные свечи и взвеси «Бифидумбактерин». Учтите, что эти препараты для лечения дисбактериоза нельзя применять деткам до 3 лет. Необходимо проконсультироваться с доктором на предмет совместимости средства с другими лекарствами.

Бифидо- и лактобактерии – сложные пробиотики

Порошок «Флорин Форте» относится к медикаментам со сложным составом. Его назначают как взрослым, так и маленьким пациентам. Грудничкам рекомендуется смешивать порошок с молоком, смесью для кормления. Для взрослых возможен прием во время еды. Чтобы лекарство сохранило «живые» бактерии, необходимо его хранить в холодильнике. Учтите, что этот препарат несовместим с некоторыми антибиотиками, которые могут повлиять на правильную работу порошка «Флорин Форте».

Очень похожий состав с предыдущим лекарством имеет средство «Линекс». Оно содержит бактерию Enterococcus faecium, способную оказать комплексное восстанавливающее влияние на микрофлору кишечника. При этом это эффективное средство можно совмещать с приемом антибиотиков.

Капсулы «Линекс» представляют препараты для лечения дисбактериоза кишечника, которые не имеют возрастных ограничений и не навредят беременным и кормящим женщинам. Для грудничков можно растворить капсулу в теплой воде. Обязательно проконсультируйтесь с доктором, ведь медикаменты данной группы содержат эубиотики в больших дозах. А они не подходят людям с иммунодефицитом или аллергикам.

Бифидобактерии и другие бактерии – пробиотики комплексного действия

Если перед вами встал вопрос о том, какие препараты от дисбактериоза данной группы выбрать, можно смело порекомендовать порошок «Бификол». Его богатый состав содержит необходимые бактерии и обогащен Escherichia coli. Средство эффективно восстанавливает микрофлору и уничтожает патогенную среду. А вот препарат «Бифиформ» включает в свой состав еще и Enterococcus faecium. Он выпускается в виде капсул с защитной оболочкой, что позволяет «доставить» живые бактерии непосредственно в кишечник, минуя кислую среду желудка. Средство не назначают детям до 2 лет.

Лактулоза – основа пребиотика

Данные препараты от дисбактериоза способны расщеплять фруктозно-галактозные дисахариды. В результате получаются низкомолекулярные органические кислоты во флоре толстого кишечника, что приводит к снижению артериального давления и подавлению вредных бактерий. Эффективными средствами являются сиропы или порошки «Дюфалак» и «Порталак», сиропы «Нормазе» и «Ромфалак». Эти пребиотики разрешены даже грудным детям, кормящим и беременным женщинам. Однако если у вас существует непереносимость фруктозы или галактозы, от лечения стоит отказаться. Непроходимость кишечника и ректальные кровотечения также являются противопоказаниями к приему.

Пребиотические составы

Такие препараты способны регулировать равновесие в микрофлоре кишечника. Эффективное средство от дисбактериоза данной группы — препарат «Хилак форте». Он содержит лактобактерии Lactobacillus acidophilus и helveticus. Состав богат на молочную кислоту, которая способна восстановить кислотность в ЖКТ. Содержание короткоцепочных кислот помогает быстро восстановить поврежденные эпителии кишечника. Препарат отлично совмещается с антибиотиками и не имеет возрастных ограничений.

Народная мудрость

Издавна народ самостоятельно определял дисбактериоз кишечника. Лечение народными средствами предполагает как соблюдение правильной диеты, так и употребление специальных продуктов, которые угнетают патогенные среды в организме. Необходимо полностью исключить продукты, которые содержат ароматизаторы, усилители вкуса, красители, консервы, жирное мясо, субпродукты, цельное молоко, кофе, алкоголь, мороженое, сладкое. Обогатите свой рацион кисломолочными продуктами. Очень полезна для кишечника растительная клетчатка, которая содержится в таких овощах:

  1. Морковь.
  2. Тыква.
  3. Капуста белокочанная.
  4. Брокколи.
  5. Кабачки.
  6. Фасоль.

Однако если у вас понос, овощи предварительно нужно отваривать. Также полезны и свежие фрукты, нежирная рыба и растительные жиры.

Многие народные средства от дисбактериоза направлены на профилактику этого заболевания. Рекомендуется употреблять по 1-2 дольки чеснока на ужин, при этом запить его нужно простоквашей. Такой рецепт благотворно действует на кислые бактерии и вызывает их активное размножение в кишечнике. Постепенно микрофлора восстановится.

Отличным средством от дисбактериоза является льняное семя. Его можно добавить в кашу (1 десертную ложечку). Также этот способ поможет при запорах. Пейте свежий сок корней селлеры перед приемом пищи. Адекватная доза составляет 1-2 ч. ложки в день.

Действенные рецепты целителей

Несмотря на многообразие препаратов для восстановления флоры кишечника, люди часто следуют рекомендациям народных целителей. И можно заверить, что некоторые способы весьма эффективны и могут победить дисбактериоз кишечника. Лечение народными средствами, как правило, проводить достаточно просто и экономно. Это и обусловило их популярность:

  1. Проглотите 3-4 горошинки черного перца, при этом необходимо их обильно запить водой. Употребляйте средство натощак, не разжевывайте. Лечение протекает примерно 2 недели.
  2. Отличным и безвредным средством от дисбактериоза станет обычная квашеная капуста. В ней содержатся полезные субстраты, кислоты, полезные организмы. Эти вещества «подстегивают» размножение полезных бактерий и поддерживают нормальную кислотность.
  3. Тыквенные семечки. Благодаря высокому содержанию масел, позволяют не только бороться с заболеванием, но еще и глистов «выгоняют». Кстати, эти паразиты очень часто и вызывают патогенную среду. Применять семечки необходимо только в сушеном виде и строго дозировано. Одной десертной ложки перед едой два раза в день достаточно, чтобы победить хворь. Курс лечения – около 3 недель.
  4. Цикорий. Его несложно найти в магазине в виде заменителя кофе. Именно это растение содержит много инулина, который отлично справляется с дисбактериозом.

Какое бы вы ни выбрали средство для себя, необходимо проконсультироваться с лечащим врачом. Запомните: даже лучшее средство от дисбактериоза может вам не подойти и причинить вред здоровью.

Сервис записи к врачу на прием в Киеве онлайн

Doc. ua — медицинский онлайн-хаб, который упрощает доступ ко всем медицинским услугам в режиме реального времени. С помощью Doc.ua пациенты могут найти врача онлайн и записаться к нему в клинику на прием. Нашим пользователям доступна база из более чем 12000 специалистов и 1800 медицинских учреждений по всей Украине.

На сайте или в приложении Doc.ua вы можете быстро записаться к доктору, который проведет консультацию и подберет эффективный способ лечения заболевания. При этом рекомендованные врачом лекарства можно заказать непосредственно на сайте в разделе «Аптека».

Doc.ua предлагает забронировать медицинские препараты, выбрав самую лучшую цену среди аптек Украины. В описании к лекарствам вы найдете способ применения и дозы, фармакологические свойства, показания и противопоказания. Получайте заказы удобно: оформляйте курьерскую доставку на препараты в вашем городе или забирайте лекарства в ближайшей точке выдачи.

Если приехать на прием в клинику для вас затруднительно, вы можете воспользоваться услугой «Вызов врача на дом» или «Онлайн-консультация с врачом». После получения вашего обращения операторы колл-центра Doc.ua свяжутся с вами в ближайшее рабочее время и предложат специалистов, которые могут приехать к вам домой либо проконсультировать вас по телефону.

На нашем портале вы найдете проверенные отзывы пациентов, которые ранее побывали на приеме у врача. Каждый отклик, оставленный пользователем портала, учитывается при формировании рейтинга. Чем выше рейтинг специалиста, тем выше его профессионализм.

Doc.ua отличается огромным каталогом диагностических центров в любом городе Украины — Киев, Одесса, Харьков, Львов, Днепр и др. Диагностические центры предлагают широкий спектр исследований: МРТ, КТ, УЗИ, эндоскопические методы исследования и другие. Для быстрого поиска центра диагностики в вашем городе используйте фильтры, которые позволяют отсортировать список учреждений по нескольким параметрам: рейтингу, популярности, а также количеству отзывов и месторасположению.

Также на Doc. ua представлено большое количество лабораторий, где можно сдать все необходимые анализы. Лаборатории предлагают широкий выбор исследований: общеклинические, гематологические, гормональные, биохимические, аллергические, иммунологические и др.

Мы стараемся быть не только максимально удобными для вас, но также беречь ваше время и средства, поэтому на сайте Doc.ua в разделе «Акции» представлены специальные предложения на медицинские услуги, прием врачей, комплексные обследования и пакетные услуги.

Записывайтесь на прием к врачу, на анализы или диагностику через Doc.ua, ведь вместе с нами медицина становится простой, удобной и доступной.

Лечение бактериального вагиноза — Клиника Здоровье 365 г. Екатеринбург

Бактериальный вагиноз

Симптомы и диагностика бактериального вагиноза

Причины бактериального вагиноза

Профилактика баквагиноза Осложнения баквагиноза

Основные принципы лечения бактериального вагиноза.

  • Антибиотики являются основой терапии бактериального вагиноза (БВ).
  • Женщины с бессимптомным носительством гарднереллы влагалищной не нуждаются в лечении.
  • Исследования, при которых перорально (через рот) и интравагинально назначались препараты, содержащие лактобациллы, показали противоречивые результаты.
  • У некоторых женщины с повторными случаями бактериального вагиноза, происходило улучшение после лечения их сексуальных партнеров. Этот подход является спорным.
  • Необходимо лечить бактериальный вагиноз у беременных женщин, чтобы уменьшить риск инфекционных осложнений.
  • Несмотря на то, что еще не проведено клинических испытаний, рекомендуется лечение бактериального вагиноза перед кесаревым сечением, абдоминальной гистерэктомией (удалением матки) и введением внутриматочной спирали.
  • Проведение бесед с пациентками о прекращении спринцеваний, принятия ванн-джакузи и применении вагинальных тампонов.
  • Рекомендуется мыться только с использованием гипоаллергенного кускового мыла или без мыла совсем, не рекомендуется применять жидкое мыло и гели для душа.
  • Эффективность диет с пробиотиками. (Пробиотики — это бактерийные препараты из живых микробных культур, предназначенные для нормализации микрофлоры кишечника). В отношении эффективности диет с лактобактериями (ацидофилин) разные исследования противоречат друг другу. Одно плацебо контролируемое исследование оценивало эффективность вагинального пробиотического продукта (в каждой капсуле содержалось 8 млрд. единиц полезных для микрофлоры влагалища бактерий-
    Lactobacillus
    rhamnosus, L acidophilus, and Streptococcus thermophilus) для лечения имевшегося бактериального вагиноза и его профилактики. Режим дозирования был такой: 7 дней прием капсул, 7- выходных дней, затем 7 дней — снова прием капсул. Такое лечение привело к снижению рецидивов бактериального вагиноза в течение двух месяцев. Также у женщин, принимавших ранее пробиотики, был более низкий уровень заболеваемости бактериальным вагинозом в течение последующих 2 — 11 месяцев.

Медикаментозное лечение бактериального вагиноза.

Антибиотики являются основой терапии бактериального вагиноза. Обычно врач назначает  метронидазол (флагил) или клиндамицин в таблетках или вагинальных свечах. Метронидазол также может быть использован в виде вагинального геля (MetroGel-вагинальный). Терапия должна быть комплексной, чтобы подавить всех возможных возбудителей бактериального вагиноза.

Клиндамицин (Cleocin). Клиндамицин — бактериостатический  антибиотик, используемый для подавления грамположительных аэробов, грамположительных и грамотрицательных анаэробов. Применяется в виде капсул и 2% вагинального крема.

Метронидазол (Flagyl). Метронидазол — бактерицидный антибиотик. Антимикробный спектр включает в себя множество грамположительных и грамотрицательных анаэробов и протозойных микроорганизмов.

В неосложненных случаях бактериальный вагиноз (БВ), как правило, исчезает после стандартного лечения антибиотиками. В некоторых случаях бактериальный вагиноз не исчезает после одного курса лечения, но может исчезнуть после второго курса лечения  тем, же антибиотиком. Другой вариант терапии заключается в смене антибиотика (например, сначала применялся метронидазол, а на второй курс назначается клиндамицин или одновременно клиндамицин с метронидазолом). Назначение метронидазола предпочтительнее, поскольку после его применения количество полезных Н2O2-продуцирующих лактобацилл восстанавливается во влагалище быстрее. При рецидивах целесообразно использование других диагностических тестов, например, ДНК-тестов, которые помогают более точно определить вид бактерий, что позволит правильно подобрать  лечение антибиотиками.

У некоторых женщин с повторными эпизодами бактериального вагиноза проводится лечение и сексуальных партнеров антибиотиками, действующих на  влагалищную гарднереллу, если при посевах она выявляется, однако целесообразность такого лечения является спорным вопросом, так как при проведении исследований эффективность лечения мужчин — партнеров для большинства пациенток не подтвердилась.

После лечения рекомендуются повторные исследования мазков, потому что у пациентки могут проявиться другие инфекции, например такие как грибы Candida.

В заключении необходимо отметить, что лечение метронидазолом и клиндамицином может изменить флору влагалища и предрасполагает пациентку к развитию вагинального кандидоза.

В чем польза продуктов, содержащих пребиотики и пробиотики

Виктория Авзалова, Гастроэнтеролог, кандидат медицинских наук,

Чем можно спровоцировать такое нарушение микрофлоры?

Любой из этих неблагоприятных факторов приводит к нарушению динамического равновесия микрофлоры кишечника с увеличением количества патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и уменьшения количества лактобактерий, бифидобактерий.

В коррекции нарушений микрофлоры кишечника необходимо учитывать, что дисбактериоз является всегда вторичным состоянием.

Коррекция нарушений микрофлоры кишечника


Какие микроогранизмы могут входить в состав пробиотиков

Пробиотики и пребиотики в продуктах

Назначение лекарственных препаратов и БАК, в состав которых входят пробиотики и пребиотики, должно строго осуществляться лечащим врачом, так как и у данной группы препаратов имеются свои показания и противопоказания.

Но пробиотики и пребиотики уже давно применяются не только в чисто медицинской практике, но и активно используются в области пищевой промышленности.

Содержит пробиотик и пребиотик:

Бифидобактерии и ацидофильные палочки, содержащиеся в молочных продуктах, более полезны, не разрушаются кислой средой желудочного сока и целиком попадают в кишечник.

Из кисломолочных продуктов особенно выраженным пробиотическим действием обладает продукт “Наринэ”, который можно изготовить в домашних условиях при помощи сухой закваски путем заквашивания молока особым штаммом ацидофильных бактерий.

Другие продукты, содержащие молочнокислые бактерии

Также полезные молочнокислые бактерии присутствуют в таких продуктах, как соленые огурцы, квашеная капуста, моченые яблоки.

Мисо-суп — ферментированная паста из соевых бобов, наполнена пробиотиками и содержит более 160 штаммов бактерий. Также молочнокислые бактерии, улучшающие пищеварение, содержатся в соевом сыре и соевом соусе, которые являются источником пробиотиков.

Пребиотики в овощах и фруктах

13 апреля 2019

Реклама

Комментарии

Лечение антибиотиками вызывает дисбактериоз кишечника и модулирует обмен веществ в куриной модели желудочно-кишечной инфекции

BMC Vet Res. 2019; 15: 37.

,

, 1, 2 , 2 , 1 , 3 , , 3 , 4 1

0 1

Caroline Ivanne Le Roy

1 Департамент пищевых и пищевых наук, University of Reading, Whiteknights, Reading, RG6 6AP UK

2 Текущий адрес: Департамент исследований близнецов и генетической эпидемиологии, King’s College London, London, SE1 7EH UK

Martin John Woodward

1 Департамент пищевых продуктов и Науки о питании, Университет Рединга, Уайтнайтс, Рединг, RG6 6AP UK

Richard John Ellis

3 Центральный отдел секвенирования, Агентство по охране здоровья животных и растений, Addlestone, Surrey, KT15 3NB UK

Roberto Marcello La Ragione

2 4 Факультет здоровья и медицинских наук, Школа ветеринарной медицины, Университет Суррея, Гилфорд, Суррей, GU2 7AL UK

Sandrine Paule Claus

1 Факультет наук о пищевых продуктах и ​​питании, Университет Рединга, Уайтнайтс, Рединг, RG6 6AP UK

1 Департамент наук о пищевых продуктах и ​​питании, Университет Рединга, Уайтнайтс, Рединг, RG6 6AP UK

2 Настоящее время Адрес: Департамент исследований близнецов и генетической эпидемиологии, Королевский колледж Лондона, Лондон, SE1 7EH UK

3 Центральный отдел секвенирования, Агентство здоровья животных и растений, Addlestone, Surrey, KT15 3NB UK

4 Факультет здравоохранения и Медицинские науки, Школа ветеринарной медицины, Университет Суррея, Гилфорд, Суррей, GU2 7AL UK

Автор, ответственный за переписку.

Поступила в редакцию 14 сентября 2018 г.; Принято 21 декабря 2018 г.

Открытый доступ Эта статья распространяется в соответствии с условиями международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что вы укажете автора(ов) оригинала и источник, предоставите ссылку на лицензию Creative Commons и укажете, были ли внесены изменения. Отказ от права Creative Commons на общественное достояние (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) относится к данным, доступным в этой статье, если не указано иное. Эта статья цитировалась в других статьях в PMC.
Дополнительные материалы

Дополнительный файл 1: Инфекция изменяет метаболическую активность ГМ и содержание полисахаридов в просвете кишечника. (A) Баллы OPLS-DA по сравнению с перекрестно подтвержденными баллами, рассчитанными с использованием спектров фекальной воды групп A и B в PM2 и инфекции в качестве предиктора. (B) График загрузки, связанный с моделью OPLS-DA, описанной в A.(EPS 14763 kb)

GUID: 637A03F0-C80E-4205-91CF-62195461F463

Дополнительный файл 2: Уровень бетаина в плазме при PM2 для всех групп, A: контрольная, B: инфицированные, C: инфицированные и получавшие лечение ( 62 ppm), D: инфицированные и пролеченные (125 ppm), E: инфицированные и пролеченные (250 ppm). * pv < 0,05; ** pv < 0,01. (EPS 614 КБ)

GUID: 4147F990-2E35-44CF-9D0F-E210F590E478

Дополнительный файл 3: Уровень глюкозы в плазме при PM2 для всех групп, A: контроль, B: инфицированные, C: инфицированные и получавшие лечение (62 D: инфицированные и пролеченные (125 ppm), E: инфицированные и пролеченные (250 ppm).* pv < 0,05; ** pv < 0,01. (EPS 601 kb)

GUID: A8EC82A4-CC5F-4CA2-B276-BB70050B5A57

Дополнительный файл 4: Линейный ответ плазмы на лечебную дозу тиамулина. (A) График оценок в сравнении с перекрестно подтвержденными оценками регрессионной модели O-PLS, рассчитанными с использованием спектров H-ЯМР 1 птиц в PM2 в качестве матрицы независимых переменных и доз тиамулина в качестве предиктора. Параметры модели: R 2 Y = 0,48, Q 2 Y = 0,43 и p -значение = 0.01 (EPS 13970 kb)

GUID: 6ABCB568-5DB8-4C8B-A3E5-E06A18F2EDEA

Дополнительный файл 5: Относительная численность OTU спирохет в процентах для каждой лечебной группы в ходе исследования. (EPS 948 КБ)

GUID: 6204AE20-8C5E-4D76-B50E-F36A367FD54A

Дополнительный файл 6: Переменная. А, нагрузки ПК1. B, Загрузка ПК2.(EPS 2121 КБ)

GUID: 5CE26145-34C9-428F-A47D-5808CAFBF10B

Дополнительный файл 7: Таблица S7 . Таблица количества необработанных чтений OTU. (CSV 3322 КБ)

GUID: 58B61D3D-DD60-4F43-A35F-D47A593AF3EA

Дополнительный файл 8: Таблица S8 . Пример ключа и метаданных для дополнительного файла 7: таблица S7. (CSV, 2 КБ)

GUID: E93301B8-46A1-4F6B-BBDA-2B41D7B09EC1

Дополнительный файл 9: Дополнительный материал S9. чек-лист ПРИБЫТИЯ. (PDF, 1067 КБ)

GUID: 8BC7A496-0DC5-45E7-B489-E0D0C6C1AC58

Заявление о доступности данных

S7 [и Дополнительный файл 8 с образцом ключа для заражения и лечения].Необработанные последовательности общедоступны в общедоступном хранилище EBI под регистрационным номером: PRJEB29134. Наборы метаболомных данных (спектры ЯМР), использованные и/или проанализированные в ходе текущего исследования, можно получить у соответствующего автора по обоснованному запросу.

Abstract

История вопроса

Заражение пищеварительного тракта желудочно-кишечными патогенами приводит к развитию симптомов от легкой диареи до более тяжелых клинических признаков, таких как дизентерия, сильное обезвоживание и, возможно, смерть.Хотя антибиотики эффективны для борьбы с инфекциями, они также вызывают дисбактериоз, который, как предполагается, приводит к изменению прибавки в весе в системах животноводства.

Результаты

Это первое исследование, демонстрирующее метаболическое влияние инфекции желудочно-кишечного тракта ( Brachyspira pilosicoli ) и его устранение с помощью лечения антибиотиками (тиамулин) на системный метаболизм хозяина (курицы) и состав кишечной микробиоты с использованием спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения 1 H и секвенирование нового поколения 16S рДНК (NGS).Были идентифицированы четкие системные метаболические маркеры инфекций, такие как глицерин и бетаин. Потеря веса у нелеченых животных частично объяснялась наблюдением модификации системного энергетического метаболизма хозяина, характеризующейся использованием глицерина в качестве предшественника глюкозы. Тем не менее, лечение антибиотиками вызвало повышение соотношения ЛПОНП/ЛПВП в плазме, что может способствовать уменьшению потери веса, наблюдаемой у обработанных птиц. Все метаболические реакции сопровождались значительным сдвигом микробиоты при инфекции или лечении антибиотиками.

Заключение

Это исследование показывает, что инфекция и лечение антибиотиками вызывают дисбактериоз, который может повлиять на системный энергетический метаболизм хозяина и вызвать изменения фенотипа и состояния здоровья.

Электронный дополнительный материал

Электронная версия этой статьи (10.1186/s12917-018-1761-0) содержит дополнительные материалы, доступные авторизованным пользователям.

Ключевые слова: Микробиота, метаболизм, антибиотик, энергия, дисбиоз

Предыстория

Известно, что состав кишечной микробиоты (ГМ) оказывает сильное влияние на здоровье хозяина посредством широкого спектра механизмов, начиная от контроля иммунных функций [1], метаболических гомеостаз [2, 3] и метаболизм лекарственных средств [4].Даже если в целом стабильный внутри вида состав GM сильно зависит от воздействия окружающей среды (питание, ксенобиотики и инфекции), и любая модификация этой экосистемы может повлиять на здоровье хозяина, изменяя симбиотические отношения, существующие между хозяином и его кишечными микробами [5]. . Например, присутствие условно-патогенного микроорганизма в пищеварительном тракте может протекать бессимптомно, но также вызывать серьезные нарушения здоровья. Кроме того, инфекция, как правило, связана с бактериальным дисбиозом в пищеварительном тракте [6], но влияние такой модификации на метаболизм хозяина и развитие таких симптомов, как потеря веса, до сих пор плохо изучено.Улучшение симптомов обычно наблюдается после лечения антибиотиками за счет уменьшения количества патогенных бактерий и уменьшения последствий их инфекции. Однако использование антибиотиков также связано с уменьшением разнообразия GM, что связано с дальнейшим ослаблением метаболизма хозяина [7].

Кишечный спирохетоз птиц (ККИ) вызывается колонизацией нижних отделов пищеварительного тракта птиц возбудителем Brachyspira pilosicoli (тип Spirochaetes; класс Spirochaetes; отряд Spirochaetales; семейство Bracyspiraceae) [8, 9].Бактерия прикрепляется к клеточной стенке и может вызвать диарею, связанную со снижением скорости роста и производства яиц [10]. Наиболее распространенным средством, используемым для борьбы с инфекцией, является тиамулин™, антибиотик семейства плевромутилина, который ингибирует синтез белка путем связывания с 50S-областью рибосомы [11, 12]. Лишь несколько исследований оценили его эффективность у цыплят, несмотря на его интенсивное использование для лечения птичьих стад в промышленности [13, 14]. На сегодняшний день это заболевание и его лечение мало изучены и остаются малоизученными.Действительно, причина таких симптомов, как потеря веса и снижение яйценоскости, до сих пор неясна. В недавнем исследовании [15] была оценена эффективность трех доз Тиамулина™ для лечения кур-несушек, перорально зараженных B. pilosicoli B2904, и было установлено, что инфекция была связана со снижением скорости роста и что птицы, получавшие Тиамулин™, выздоравливали от инфекции независимо от использованной дозы, в то время как поддержание массы тела наблюдалось только в ответ на две самые высокие дозы. Кроме того, Тиамулин™ значительно уменьшал другие симптомы, связанные с инфекцией, а также системное распространение B. пилосиколи . Тем не менее, через три недели после прекращения лечения антибиотиками все еще наблюдалась колонизация пищеварительного тракта возбудителем. Таким образом, мы пришли к выводу, что это исследование представляет собой интересную модель инфекции для понимания реакции системного метаболизма и микробиоты кишечника хозяина на колонизацию пищеварительного тракта патогеном. Кроме того, план эксперимента позволяет проводить продольное исследование влияния лечения антибиотиками на суперорганизм (то есть на хозяина и микробиоту его кишечника).В этой статье мы представляем результаты, полученные после анализа образцов биопсии и биожидкости, собранных в ходе предыдущего исследования [15]. Для оценки системного метаболического ответа хозяина на инфекцию и лечение антибиотиками мы использовали метаболомику на основе 1 Н-ЯМР, которая позволяет нецелевую оценку метаболических колебаний, происходящих в биологических системах. Поскольку микробиота кишечника неразрывно связана с метаболическими реакциями хозяина, ее состав в ответ на инфекцию и лечение контролировали с помощью секвенирования гена 16S рРНК (16S NGS). Оба анализа позволили по-новому взглянуть на влияние инфекции и лечения антибиотиками на здоровье хозяина, объяснив физиологическую реакцию как на бактериальное, так и на химическое воздействие.

Результаты

Инфекция и лечение антибиотиками влияют на рост и яйценоскость

Влияние инфекции и яйценоскости отслеживали на протяжении всего исследования во всех группах (A, контрольная; B только инфицированные; CE, инфицированные и получавшие Тиамулин™ от самой низкой до максимальная доза). Заражение B.pilosicoli приводил к значительному снижению скорости роста (рис. б), но к концу исследования цыплята из группы Б (зараженные) весили меньше, чем птицы из группы А (контроль), но этот результат не был значимым. Две самые высокие дозы Тиамулина™ (группа D и E) были способны поддерживать рост цыплят, поскольку к концу исследования птицы из этих двух групп имели более высокий вес, чем в контрольной группе, и этот показатель был значительно выше, чем в инфицированной группе ( p -значение < 0. 05). Однако у животных, получавших самую низкую дозу (группа C), средний вес в конце исследования был аналогичен весу инфицированной группы (B) и значительно отличался от трех других (A, D и E). . Это предполагает, что только более высокие дозы антибиотиков связаны с поддержанием скорости роста во время инфекции.

Экспериментальный план ( a ) и масса тела птицы ( b )

Инфекция вызывает системный метаболический ответ хозяина

Системный метаболический ответ на инфекцию B.pilosicoli наблюдали сразу после окончания периода заражения (день 6). O-PLS-DA показал, что инфекция была связана с модификацией метаболомов почек, печени, селезенки и плазмы (рис. a, b, c и d). Печень инфицированных птиц была богаче глицерином, лактатом, холином, сукцинатом и ацетатом (рис. а). В селезенке инфекция привела к снижению O -фосфохолина, глутамина и АМФ и повышению уровня глицерина, урацила, цитидина и лейцина (рис. б). В почках инфекция вызывала увеличение содержания глицерина, урацила и ксантина при одновременном снижении содержания инозина (рис. в). Повышенное содержание бетаина и глицерина также было связано с инфекцией в плазме (рис. d). После заражения (PM1) содержимое толстой кишки инфицированных птиц было богаче полисахаридами и аминокислотами (дополнительный файл 1). Через две недели после окончания периода заражения (PM2) почки, печень и селезенка инфицированных, но не леченых птиц восстановили свой метаболический гомеостаз (больше не было обнаруживаемых метаболических различий между контрольной и любой другой группой), что указывает на отсутствие метаболические изменения наблюдались в ответ на инфекцию.Однако уровень глюкозы в плазме зараженных птиц снизился (рис. д) примерно на 50%.

Инфекция B. pilosicoli связана с основными изменениями системного метаболизма. a Графики баллов (правая панель) и нагрузки (левая панель) модели O-PLS-DA, рассчитанные с использованием спектров 1D-ЯМР печени птиц при PM1 в качестве матрицы независимых переменных и инфекции в качестве предиктора инфицированных птиц (красный квадрат) и неинфицированные птицы (синий кружок). Форма графиков нагрузки представляет собой среднее стандартное отклонение всех спектров ЯМР, полученных для данной модели, и умноженное на вес модели O-PLS DA, что позволяет визуализировать, связаны ли метаболиты с инфекцией положительно (указывая вниз) или отрицательно (указывая вверх).Цветовая шкала представляет уровень корреляции между каждой точкой данных и заражением. b То же для селезенки. c то же для почки. d то же для плазмы. e То же для плазмы на Т1

В подвздошной, толстой и слепой кишках и поджелудочной железе на протяжении всего исследования не наблюдалось значительных метаболических изменений в ответ на инфекцию.

К концу исследования дифференцировать метаболически инфицированных птиц от неинфицированных не удалось.

Лечение Тиамулином™ ослабляет метаболический ответ на инфекцию

Затем мы исследовали, модулирует ли Тиамулин™ метаболический ответ хозяина на инфекцию. На PM2 в ответ на инфекцию наблюдался более высокий уровень бетаина в плазме ( p — значение < 0,01 - Дополнительный файл 2). Однако у птиц, инфицированных и обработанных тиамулином™, уровень бетаина в плазме был таким же, как и у контрольной группы, хотя этот ответ не зависел от дозы.

В предыдущем разделе было описано, что инфекция вызывает падение уровня глюкозы в куриной плазме ( p -значение < 0.05 – Тест Уилкоксона-) в PM2, который частично облегчался лечением тиамулином™. Это не было полностью исправлено лечением тиамулином™, так как снижение уровня глюкозы в плазме все же было ниже, чем в контрольной группе ( p -значение < 0,05). Интересно, что уровни глюкозы в плазме были обратно пропорциональны дозе лечения (дополнительный файл 3).

Терапия тиамулином вызывает значительный сдвиг в метаболизме липидов

График PCA, показывающий общее влияние лечения на метаболические профили плазмы на PM2 (рис.а) выявили четкое разделение между оценками птиц, получавших Тиамулин™, и птиц, не получавших основного компонента 1 (ПК1). Действительно, множество птиц, получавших антибиотики, занимали метаболическое пространство, отличное от контрольных и инфицированных, но нелеченных птиц. Метаболические профили плазмы цыплят, получавших Тиамулин™, характеризовались повышенным уровнем липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) и сниженным уровнем липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) (рис. а, б и в). Линейная регрессия метаболических профилей в зависимости от дозы антибиотиков показала, что влияние на липопротеины зависело от дозы (дополнительный файл 4).

Тиамулин вызывает изменения метаболизма в плазме. график баллов PCA для первого (T1 48%) и четвертого (T4 5%) основных компонентов, полученный из модели, рассчитанной с использованием спектров 1d-ЯМР плазмы птиц при PM2. b Цветной график спектров 1D-ЯМР плазмы контрольных птиц (синий), инфицированных и необработанных птиц (розовый) и обработанных птиц (зеленый). c График загрузки основного компонента 1 (PC1), молекулы, направленные вверх, положительно коррелируют с PC1, молекулы, направленные вниз, отрицательно коррелируют с PC1. d График загрузки основного компонента 4 (PC4), молекулы, направленные вверх, положительно коррелируют с PC4, молекулы, направленные вниз, отрицательно коррелируют с PC4. e График показателей PCA, полученный на основе модели, рассчитанной с использованием спектров ЯМР 1 H HR-MAS, полученных из биоптатов интактной печени. f График нагрузок основного компонента 1 (PC1) модели PCA, представленной в E

Поскольку печень является центральным органом, регулирующим метаболизм холестерина и липидов, метаболические профили интактных биоптатов печени были созданы с использованием HR-MAS 1 Н-ЯМР спектроскопия.Этот анализ показал, что печень птиц, получавших Тиамулин™, была богаче липопротеинами, чем птицы, не получавшие лечения (рис. c и f), что свидетельствует о том, что печень секретировала больше ЛПОНП, и подтверждает влияние Тиамулина™ на центральный метаболизм липидов и холестерина.

Тиамулин™ ускоряет постпубертатный метаболический сдвиг

При изучении влияния тиамулина™ на метаболические профили плазмы цыплят в общем исследовании (все группы PM1, 2 и 3) выяснилось, что возраст также является сильным источником метаболических нарушений. вариация (рис.). Действительно, линейная регрессия, рассчитанная по метаболическим профилям плазмы с использованием возраста в качестве предиктора, показала хорошую модель, на что указывают сильные параметры (R 2 Y = 0,52, Q 2 Y = 0,51 и p -значение = 0,002). . Возраст птицы ассоциировался со снижением уровня ЛПВП, глюкозы, сукцината и лактата, в то время как уровень ЛПОНП повышался (рис. ). Анализ показателей (рис. b) показал, что птицы, получавшие тиамулин™, были метаболически сходны с птицами в постпубертатном периоде (PM3 = 19 недель) на PM2 (= 17 недель) и, наоборот, у нелеченных птиц метаболические профили были сходны с птицами. из препубертатной группы (PM1 = 16 недель).

Возраст связан с повышением ЛПОНП и снижением ЛПВП и уровня глюкозы. a Цветной график спектров 1D-ЯМР плазмы 16-недельных птиц (синий), 17-недельных птиц (красный) и 19-недельных птиц (черный). b График показателей регрессионной модели O-PLS, рассчитанных с использованием 1 H-ЯМР-спектров птиц во все моменты времени в качестве матрицы независимых переменных и возраста птиц в качестве предиктора. c График коэффициента регрессии O-PLS в зависимости от возраста птицы

Инфекция и Тиамулин™ изменили состав микробиоты слепой кишки

Состав популяции микробиоты слепой кишки был оценен в ответ на инфекцию и лечение Тиамулином™ с использованием 454 16S пиросеквенирования V4 -V5 гипервариабельные области.Популяция микробиоты слепой кишки была стабильной с течением времени в контрольной группе, как показано на графиках оценки PCA (рис. a–c и дополнительный файл 5).

Лечение тиамулином способствует глубокому изменению микробного разнообразия и популяции кишечника. a Графики показателей PCA, рассчитанные с использованием относительного процента численности бактерий на уровне семейства для всех птиц, но отображающие только показатели ( n  = 8) контрольных (синий кружок) и инфицированных птиц (розовый квадрат) после заражения (T0) . b Тот же график оценок PCA, что и для A, но отображающий только оценки ( n  = 8) контрольной группы (синий кружок), инфицированных птиц (розовый квадрат) и птиц, получавших самую высокую дозу (зеленые треугольники) после лечения (T1). c Тот же график оценки PCA, что и для A и B, но отображающий только оценки контрольной (синий кружок), зараженной птицы (розовый квадрат) и обработанной птицы (зеленые треугольники) через три недели после обработки (T2). d Альфа-разнообразие рассчитано для контрольных, инфицированных и обработанных птиц независимо от времени. e Круговая диаграмма, показывающая относительную численность бактерий на уровне типа для каждой группы (контрольная, инфицированная и получавшая лечение) для трех моментов времени, выбранных в этом исследовании

Инфекция была связана с модификацией комменсальной микробиоты слепой кишки по сравнению с контролем (рис. а и б), но к концу исследования баланс сообщества восстановился (рис. в). Эта модификация микробиоты слепой кишки в основном была связана с увеличением количества Lactobacillales, Burkholderiales и Campylobacterales, причем эти два последних порядка относятся к типу Proteobacteria (дополнительный файл 6).

После лечения Тиамулином™ класс Spirochaetes, к которому принадлежит B. pilosicoli , больше не обнаруживался с помощью подходов секвенирования 16S (рис. e). Тем не менее, этот класс бактерий снова появился через три недели после окончания лечения тиамулином™. Кроме того, в предыдущей публикации было показано, что при использовании более целенаправленных методов B. pilosicoli обнаруживались в каждой инфицированной группе на протяжении всего исследования [15]. Их относительный процент численности был выше, чем в обеих необработанных группах (до 25%), что, вероятно, связано с переходом бактерий в состояние покоя при лечении Тиамулином™ [16].

Используя MANOVA, мы заметили, что α-разнообразие в значительной степени связано с возрастом ( p -значение = 0,047) и лечением ( p -значение = 0,001), а также с взаимодействием между обоими факторами возраст*лечение (p-значение = 7,1*10 − 5 ). Как и ожидалось, дозировка антибиотика была связана с сильным снижением бактериального α-разнообразия по сравнению с контрольной и инфицированной группами на PM2 (значение p = 0,007 и 4,8*10 – 4 соответственно, рис. d). Однако к концу исследования α-разнообразие группы, получавшей лечение, было эквивалентно двум другим группам в тот же момент времени.Лечение тиамулином™ привело к значительному изменению β-разнообразия микробного сообщества слепой кишки (рис. b и дополнительный файл 5). Это было вызвано снижением относительной численности Firmicutes (с 30 до 22%) и увеличением доли Bacteroidetes (с 60 до 71%). Соотношение Firmicutes/Bacteroidetes было изменено приблизительно с 1:2 до 1:3. Хотя микробное разнообразие развивалось в течение трех недель после лечения Тиамулином™, оно не смогло вернуться к исходному составу к концу исследования и продолжало содержать относительно высокое относительное количество протеобактерий (рис.б и в).

Обсуждение

Несмотря на то, что было опубликовано несколько исследований [17–20], мало что известно о взаимосвязи между устойчивостью кишечной микробиоты при кишечных заболеваниях, ее восстановлением после лечения антибиотиками и общим влиянием на метаболизм хозяина. пробел в знаниях, который мотивировал это исследование. Желудочно-кишечные инфекции часто вызывают дисбактериоз микробиоты кишечника, как и лечение антибиотиками [21, 22]. Известно, что состав кишечной микробиоты играет важную роль в росте хозяина, а тяжелый дисбактериоз может быть причиной аномального развития [23, 24].Мы определили, что интервенционное исследование, направленное на оценку эффективности Тиамулина™ против АИС [15], позволит нам оценить, вызвано ли снижение скорости роста, связанное с инфекцией, дисбактериозом микробиоты слепой кишки. Мы предположили, что модификации кишечной микробиоты в результате инфекции приведут к модулированию метаболического гомеостаза хозяина, который был скорректирован в этом исследовании с помощью лечения тиамулином™. Материалы, используемые для этой статьи, были взяты из исследования, которое показало значительное снижение темпов роста среди других клинических последствий у кур-несушек в ответ на B.pilosicoli [15].

Инфекция привела к увеличению количества протеобактерий, многие из которых являются условно-патогенными микроорганизмами, связанными с повышенным риском диареи. Интересно, что обогащение Proteobacteria было связано с метаболическим синдромом [25]. Увеличение протеобактерий ранее наблюдалось в ответ на пенициллин у мышей, что было связано с увеличением массы тела, процента жировой массы и заболеваемостью диабетом [26].

В настоящем исследовании инфекция и бактериальный дисбиоз сопровождались глубокими системными метаболическими изменениями хозяина.Ряд пораженных инфекцией тканей (печень, селезенка, почки и плазма) свидетельствует о системной метаболической реакции организма на колонизацию и дисбактериоз. Интересно, что повышенные уровни глицерина были заметны во всех вышеупомянутых компартментах. Системное повышение уровня глицерина является маркером липолиза в жировых тканях, где триглицериды лизируются на свободные жирные кислоты и глицерин под действием ферментов липазы. Затем глицерин высвобождается в общий кровоток для использования в качестве предшественника глюкозы в печени и/или почках.Этот механизм обычно активируется длительным низким уровнем глюкозы в плазме. Кроме того, желудочно-кишечная инфекция может нарушать всасывание глюкозы из-за нарушения кишечного барьера, и, таким образом, возможно, что это явление также было вызвано снижением всасывания глюкозы в кишечнике. Известно, что B. pilosicoli сильно разрушает стенку кишечника [27], что также подтверждается наблюдением более высоких уровней глюкозы в фекалиях инфицированных птиц. Повышенное содержание полисахаридов в фекалиях также может быть связано со способностью B.pilosicoli для деградации муцина [28–30]. Кроме того, одновременное увеличение содержания бутирата и ацетата, наблюдаемое во время инфекции, свидетельствует о более высокой ферментации углеводов и, следовательно, об изменении метаболической активности ГМ. Концентрация глюкозы в плазме строго контролируется и регулируется, поскольку ее уровень необходимо поддерживать для поддержания основных функций, таких как мозговая и мышечная активность. Для поддержания уровня глюкозы глюконеогенез из глицерина активируется во время голодания, что требует накопления жира для высвобождения неэтерифицированных жирных кислот и глицерина в плазме.Это уменьшение жировой массы, вероятно, связано со снижением скорости роста, наблюдаемым у цыплят, колонизированных B. pilosicoli [15, 31]. Однако падение уровня глюкозы в плазме, наблюдаемое на PM2 после восстановления уровня глицерина, предполагает, что этот альтернативный метаболический путь не может поддерживать потребность в энергии в течение длительного времени.

Полное восстановление метаболического гомеостаза хозяина в ответ на инфекцию было достигнуто в конце исследования (PM3). Это совпало с чистым снижением процента инфицированных птиц во всех группах [15] и стабилизацией микробиоты слепой кишки.Следовательно, симптомы и заметные метаболические реакции хозяина на инфекцию возникали только при наличии дисбактериоза микробиоты. Такое наблюдение предполагает, что как присутствие патогена, так и модификация микробного сообщества кишечника необходимы для запуска метаболических реакций хозяина. Идея о том, что GM может действовать как буфер, регулирующий метаболический ответ хозяина на инфекцию патогеном, была частично исследована Khosravi et al. [32], которые показали, что инфекция Helicobacter pylori вызывала более сильный метаболический ответ хозяина (модификация уровней инсулина, грелина и лептина) у стерильных мышей, чем у обычных животных, и что вызванное инфекцией снижение скорости роста наблюдалось только в отсутствие ГМ.Эта толерантность к патогену была связана с тренировкой иммунной системы. Таким образом, инфекцию можно рассматривать как реакцию на изменение экосистемы, а не на колонизацию одним патогеном.

В этом наборе результатов Тиамулин™ был способен снижать индуцированный инфекцией метаболический ответ, повышать уровень бетаина и снижать уровень глюкозы в плазме. Хотя доза-эффект наблюдался на уровне инфекции, измеренном положительными мазками [15], это не было верно для уровней бетаина в плазме.Вероятно, повышение уровня бетаина в ответ на инфекцию связано с центральной осмопротекторной ролью этой молекулы [33]. Бетаин ранее использовался в качестве пищевой добавки для цыплят из-за его способности защищать кишечный барьер от патогенов, таких как Coccidia [34]. Действительно, инвазия клеток B. pilosicoli вызывает отек и нарушение осмотического баланса [9, 27]. Таким образом, повышенное количество бетаина (обычно поступающего из почек) может транспортироваться из других тканей к кишечному барьеру через общую циркуляцию, что объясняет его повышенный уровень в плазме.

Мы наблюдали, что нормальное «метаболическое старение» (снижение уровней ЛПВП/ЛПОНП и глюкозы в плазме), происходящее в период полового созревания, ускорялось при лечении тиамулином™. Интересно, что снижение соотношения ЛПВП/ЛПОНП и уровня глюкозы в общем кровотоке было связано с повышением уровня стероидных гормонов и, в частности, прогестерона [35–37]. Цитохром P450 3A (CYP3A, важное семейство ферментов, присутствующих в печени и участвующих в детоксикации лекарств) участвует в метаболизме стероидных гормонов (прогестерона, эстрогена и тестостерона).Кроме того, в нескольких исследованиях было показано, что снижение активности CYP3A обычно приводит к повышению концентрации стероидных гормонов в плазме [38–40]. Антибиотики — это активные молекулы, которые могут напрямую взаимодействовать с хозяином, если они способны преодолевать кишечный барьер. Сообщалось, что Тиамулин™ взаимодействует с CYP3A, образуя комплекс, который приводит к инактивации цитохрома in vitro и in vivo [41–44]. Таким образом, вполне вероятно, что наблюдаемый метаболический сдвиг в период до полового созревания является результатом взаимодействия Тиамулина™ с метаболизмом прогестерона.Это также подтверждается тем фактом, что начало яйцекладки, которое сильно зависит от созревания метаболизма стероидов, произошло раньше в двух группах, получавших самые высокие дозы Тиамулина™ [15]. В целом это подтверждает потенциальное взаимодействие Тиамулина™ с метаболизмом стероидов.

Наконец, сдвиг липопротеинов также может быть вызван модификациями микробиоты кишечника вследствие лечения антибиотиками. Метаболическое взаимодействие хозяин-ГМ широко исследовано. Действительно, во многих исследованиях сообщается, что ожирение и гомеостаз энергетического метаболизма тесно связаны с составом микробиоты кишечника [24, 45–47].Кроме того, было продемонстрировано, что использование антибиотиков до полового созревания у людей и мышей может быть связано с повышенным риском метаболических нарушений из-за модулирования микробиоты кишечника [26, 48, 49]. Интересно, что низкое соотношение Firmicutes/Bacteroidetes, как сообщается, связано с худощавым фенотипом и более низким риском развития нарушений, характеризующихся модификацией метаболизма холестерина [2, 50, 51]. Однако это противоречит нашим наблюдениям, которые предполагают, что обнаруженная модификация ЛПОНП/ЛПВП может быть вызвана самим тиамулином, а не модификациями микробиоты: является ли это общим явлением для некоторых или всех классов антибиотиков, несомненно, очень заслуживает будущего. изучать.Также мы должны помнить, что другие бактериальные изменения могут быть ответственны за модификацию метаболизма холестерина: действительно известно, что некоторые молочнокислые бактерии способны метаболизировать холестерин [52], и их использование в качестве кормовой добавки у цыплят-бройлеров приводило к снижению концентрации холестерина в плазме [52]. 53]. Следовательно, потребуются дальнейшие эксперименты, чтобы разделить эти аспекты.

Заключение

Эта работа демонстрирует, что состав микробиоты кишечника может быть связан с нарушениями системного метаболизма хозяина, которые приводят к фенотипическим изменениям.Мы наблюдали, что инфекция была связана с дисбактериозом, снижением усвоения питательных веществ и нарушением энергетического обмена хозяина, что приводило к значительному снижению скорости роста. Были идентифицированы два системных биомаркера инфекции: глицерин и бетаин. Повышение системного глицерина ясно иллюстрирует метаболическую адаптацию хозяина к кишечной инфекции, направленную на обеспечение достаточного количества энергии для выживания. Однако предположительно все же наблюдалось нарушение прибавки массы тела, поскольку глицерин, вероятно, поступал из жировой ткани.Кроме того, симптомы, связанные с колонизацией патогеном, наблюдались только в том случае, если они были связаны с микробным дисбиозом кишечника. Это открытие убедительно подтверждает потенциальную защитную роль микробиоты кишечника от условно-патогенных микроорганизмов. Это указывает на необходимость проведения дальнейших исследований для понимания экологического контекста, в котором патогенная бактерия может стать вредной для своего хозяина. В этом исследовании лечение антибиотиками уменьшало инфекцию и связанные с ней симптомы при одновременном изменении метаболизма холестерина.На основании наших результатов и ранее опубликованной работы мы выдвинули гипотезу о том, что метаболический ответ хозяина на лечение антибиотиками является результатом одновременной модификации состава кишечной микробиоты и метаболизма стероидов. Эти данные свидетельствуют о том, что влияние потребления антибиотиков на энергетический метаболизм хозяина следует изучать как ответ на прямое взаимодействие и через посредничество кишечной микробиоты. Наконец, антибиотик вызвал снижение α-разнообразия с последующим дисбактериозом, который может привести к большей уязвимости к колонизации патогеном и способствовать рецидиву.Следовательно, следует рассмотреть возможность лечения антибиотиками в сочетании с пищевыми добавками, такими как пре/про/симбиотики, для восстановления «более здоровой» кишечной микробиоты после вмешательства.

Методы

Изучение животных и план эксперимента

Кратко: 150 коммерческих кур-несушек NovoGen Brown в возрасте 16–17 недель, полученных от коммерческого поставщика (Tom Barron Ltd., Великобритания), содержали в APHA (Аддлстоун, Суррей, Великобритания). в соответствии с инструкциями Министерства внутренних дел (лицензия Министерства внутренних дел -PPL 70/7249-), и все процедуры проводились в соответствии с Законом о научных процедурах в отношении животных 1986 года.После исследования животных сжигали на месте, чтобы избежать риска заражения патогеном окружающей среды.

Экспериментальный план был описан ранее Woodward et al. [15] и для наглядности сведены на рис. Животных случайным образом распределяли по пяти группам ( n  = 30), получая следующие обработки: группа A: необработанные, неинфицированные контроли; Группа B: необработанные, инфицированные контроли; Группа C: инфицированные + тиамулин™ при 62,5 млн; Группа D: инфицированные + тиамулин™ при 125 мд; Группа E: инфицированные + тиамулин™ при 250 ppm.

После нейтрализации зоба птиц заражали через желудочный зонд 1 мл суспензии B. pilosicoli B2904 (5 × 10 9  КОЕ/мл) в течение пяти дней каждые два дня [54]. Через неделю после окончания заражения группы C, D и E получали различные концентрации тиамулина™ в питьевой воде в течение пяти дней. Затем птиц наблюдали в течение трех недель. Корм представлял собой нелекарственные гранулы несушек (Додсон и Хоррелл), а воду давали из водопровода, птицы имели доступ к обоим вволю.

Сбор образцов при исследовании на животных

Биопсии, образцы плазмы и фекалий были собраны во время патологоанатомического исследования в трех временных точках: на следующий день после окончания инфекционного процесса (PM1), на следующий день после окончания антибиотикотерапии лечения (РМ2) и в конце исследования (РМ3) (рис. а). Для каждой группы и момента времени случайным образом отбирали восемь птиц и проводили эвтаназию путем седативного действия с использованием смеси ромпун/кетамин в виде внутримышечной инъекции с последующей внутривенной инъекцией пентобарбитона.Кровь брали сначала из сердца, а сыворотку замораживали при - 80 °C после образования сгустка. Образцы биопсии ткани (приблизительно 1   г для всех тканей) и образцы фекалий, собранные непосредственно из кишечного тракта енота и слепой кишки (приблизительно 1   г), были быстро заморожены в жидком азоте, а затем сохранены при температуре - 80  °C для будущей оценки их метаболический состав и профиль микробиома слепой кишки.

Данные об общем влиянии инфекции и лечения Тиамулином™ на уровень инфекции, рост, состояние здоровья птиц (оценивается путем наблюдения за оперением птицы и развитием мускулатуры), яйценоскость, потребление воды и корма также приведены в вышеупомянутом статье [15] и здесь не повторяются.

Подготовка проб для ЯМР

Экстракцию полярных метаболитов почек, поджелудочной железы, селезенки и печени проводили путем гомогенизации 0,1 г ткани в 1 мл смеси 3:1 ( v /v) метанол/H 2 O с использованием раствора тканевый лизер [55]. После центрифугирования (10 мин при 12000×g) супернатанты высушивали в скоростном вакууме и ресуспендировали в 600 мкл фосфатного буфера (0,2М), содержащего 90% D 2 O и 10% H 2 O плюс 0,01%. 3-(триметилсилил)пропионат-2,3-d4 натрия (TSP используется в качестве внутреннего стандарта).Затем образцы (0,5 мл) переносили в 5 мм ЯМР-пробирки для сбора. Образцы плазмы смешивали с фосфатно-солевым буфером с 90% D2O в соотношении 2:1 (об./об.), затем 0,5 мл переносили в 5 мм пробирки для ЯМР. 0,0150 мкг биоптата печени добавляли с фосфатным буфером в центрифуге для твердотельной ЯМР-спектроскопии.

ЯМР-спектроскопия

Для тканей 1 Спектры Н-ЯМР были получены на спектрометре Bruker Advance 700 МГц с использованием стандартной импульсной программы noesypr1D с предварительным насыщением водой (задержка релаксации 2 с и время перемешивания 100 мс).Спектры 1D ЯМР плазмы были получены с использованием импульса Карра-Перселла-Мейбум-Гилла (CPMG). Биоптаты печени были получены на спектрометре Bruker Advance с частотой 500 МГц с использованием зонда 1 H HR MAS. Спектры были получены с использованием стандартного импульса noesypr1D, а также CPMG. Для всех матриц были проведены эксперименты 2D ЯМР на выбранных образцах, чтобы помочь идентифицировать метаболиты, а также ранее опубликованный атлас метаболизма цыплят [55]. Спектры были получены с использованием 256 сканирований с 16 фиктивными сканами (DS). Все спектры были записаны как 64 тыс. точек данных (15  м.д.).

Методы выделения ДНК для популяционных исследований на основе 16S

ДНК из образцов фекалий экстрагировали с использованием набора для выделения ДНК PowerSoil® ( MO BIO Laboratories, Inc) , приобретенного Qiagen. Для обеспечения качества образцов ДНК после экстракции была проведена ПЦР универсальной области V4-V5 16S рРНК (условия циклирования: 94°С в течение 3 мин; 30° циклов: 94°С в течение 30°с, 55°С в течение 45°с, 72°C в течение 1 мин, затем 72°C в течение 8 мин) и концентрацию оценивали с помощью капли Nano.Праймеры для ПЦР были следующими:

Секвенирование 16S следующего поколения

Аликвоты выделенной ДНК амплифицировали с универсальными праймерами для областей V4 и V5 гена 16S рРНК. Праймеры U515F (5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTA) и U927R (5′-CCCGYCAATTCMTTTTRAGT) были разработаны для обеспечения амплификации как бактериальных, так и архейных участков рибосомных генов [56]. Праймеры прямого слияния состояли из праймера A GS FLX Titanium и библиотечного ключа (5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG) вместе с одним из набора из восьми 10-основных мультиплексных идентификаторов (MID) (Roche Diagnostics Ltd., СОЕДИНЕННОЕ КОРОЛЕВСТВО). Праймеры для обратного слияния включали титановый праймер B GS FLX и библиотечный ключ (5’-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG). Амплификацию проводили с помощью полимеразы FastStart HiFi (Roche Diagnostics Ltd., Великобритания) при следующих условиях циклирования: 94°С в течение 3 мин; 25 циклов: 94 °C в течение 30 с, 55 °C в течение 45 с, 72 °C в течение 1 мин; затем 72 °C в течение 8 мин. Ампликоны очищали с использованием магнитных шариков Ampure XP (Beckman Coulter) и измеряли концентрацию каждого образца с использованием анализа Picogreen на основе флуоресценции (Invitrogen).Концентрации были нормализованы перед объединением образцов в партии до 16, каждая из которых впоследствии будет идентифицирована своим уникальным MID. Затем объединенные образцы подвергали однонаправленному секвенированию, начиная с прямого праймера, на платформе 454 GS FLX Titanium в соответствии с инструкциями производителя (Roche Diagnostics).

Конвейер Ampliconnoise [57] был использован для разделения набора данных на отдельные файлы для каждого образца в соответствии с используемыми адаптерами MID, а затем для удаления ошибок пиросеквенирования, ошибок ПЦР и химерных последовательностей.Для дальнейшего анализа оставляли только последовательности длиной более 400 оснований. Затем обработанные последовательности были классифицированы с использованием процесса выбора открытых эталонных OTU, реализованного в QIIME v1.9.1 (Caporaso, et al. 2010), по базе данных генов 16S рРНК Greengenes (http://greengenes.secondgenome.com/downloads/). Полученное распределение OTU по нескольким образцам было дополнительно проанализировано с использованием QIIME v1.9.1. обобщить распределения и исследовать альфа- и бета-разнообразие [58].

Статистический анализ

Для метабономического анализа после применения экспоненциального окна с расширением линии 0.3 Гц и преобразование Фурье, спектры индивидуально фазировали и корректировали по базовой линии в программе MestReNova (Mestrelab Research v.8.1.2). Затем спектры были импортированы в Matlab (Mathwork® v2013a), где они были откалиброваны по TSP (δ 0,00) для всех тканевых экстрактов, лактату (δ 1,33) для плазмы и протону H 1 α-глюкозы (δ 5,23) для биопсия печени. Спектры нормировались для каждой матрицы индивидуально с помощью метода вероятностных отношений [59]. Метаболические различия между образцами оценивали с помощью анализа основных компонентов (PCA).Этот шаг также использовался для удаления потенциальных выбросов, которые считались таковыми, если при регистрации не удалось получить спектр, сравнимый с другими образцами того же набора. Когда были выявлены интересующие групповые кластеры, ортогональная проекция на дискриминантный анализ латентной структуры (O-PLS DA) использовалась для оценки метаболических вариаций между группами с использованием спектров ЯМР в качестве матрицы независимых переменных и инфекции или лечения в качестве вектора прогнозирования. Алгоритм регрессионных моделей предоставлен компанией Korrigan Sciences Ltd.

Критерий Уилкоксона использовали для оценки значимости вариаций между группами в отношении массы тела и α-разнообразия с использованием R. Также был проведен тест MANOVA для определения влияния времени, инфекции и лечения на α-разнообразие на R (модель < − aov(α-разнообразие ~ время*инфекция*лечение). Наконец, из-за глубины секвенирования и метода мы решили провести анализ микробного сообщества на уровне семейства, а не на более низком таксономическом уровне. Статистический анализ проводился на нулевом завышенном логарифме преобразованное относительное изобилие.Всего было обнаружено 54 семейства, но только 40 присутствовали как минимум в 25% образцов. Бета-разнообразие на уровне семьи было выполнено путем расчета евклидова расстояния между особями.

Дополнительные файлы

Дополнительный файл 1: (14M, eps)

Инфекция изменяет метаболическую активность ГМ и содержание полисахаридов в просвете кишечника. (A) Баллы OPLS-DA по сравнению с перекрестно подтвержденными баллами, рассчитанными с использованием спектров фекальной воды групп A и B в PM2 и инфекции в качестве предиктора.(B) График загрузки, связанный с моделью OPLS-DA, описанной в A. (EPS 14763 kb)

Дополнительный файл 2: (615K, eps)

Уровень бетаина в плазме при PM2 для всех групп, A: контроль, B: Зараженные, C: инфицированные и пролеченные (62 ppm), D: инфицированные и пролеченные (125 ppm), E: инфицированные и пролеченные (250 ppm). * pv < 0,05; ** pv < 0,01. (EPS 614 kb)

Дополнительный файл 3: (601K, eps)

Уровень глюкозы в плазме при PM2 для всех групп, A: контроль, B: инфицированные, C: инфицированные и пролеченные (62 ppm), D: инфицированные и пролеченные (125 ppm), E: инфицированные и пролеченные (250 ppm).* pv < 0,05; ** pv < 0,01. (EPS 601 kb)

Дополнительный файл 4: (14M, eps)

Линейный ответ плазмы на лечебную дозу тиамулина. (A) График оценок в сравнении с перекрестно подтвержденными оценками регрессионной модели O-PLS, рассчитанными с использованием спектров H-ЯМР 1 птиц в PM2 в качестве матрицы независимых переменных и доз тиамулина в качестве предиктора. Параметры модели: R 2 Y = 0,48, Q 2 Y = 0,43 и p -значение = 0,01 (EPS 13970 кб)

Дополнительный файл 5 в процентах: (948K, eps05 относительное содержание) 900 OTU спирохет для каждой лечебной группы в ходе исследования.(EPS 948 kb)

Дополнительный файл 6: (2.0M, eps)

Нагрузки, связанные с графиком оценок PCA на рис., рассчитаны с использованием относительного количества OTU для всех образцов в качестве матрицы независимой переменной. А, нагрузки ПК1. B, Загрузка ПК2. (EPS 2121 КБ)

Дополнительный файл 8: (2.0K, csv)

Таблица S8 . Пример ключа и метаданных для дополнительного файла 7: таблица S7. (CSV 2 kb)

Благодарности

Авторы выражают благодарность Novartis за финансирование испытаний на животных.Мы также хотим поблагодарить сотрудников APHA и доктора Люка Дж. Мэппли за помощь в исследованиях in vivo, а также доктора Радослава Михала Ковальчика из Химико-аналитического центра (CAF) Университета Рединга за его помощь во время получения спектров 2D ЯМР. .

Финансирование

Мы признательны за поддержку компании Novartis, которая спонсировала исследование на животных, о котором сообщалось ранее [15], в рамках которого с разрешения были проведены эти дополнительные исследования.

Доступность данных и материалов

Данные о микробиоме, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью в Дополнительный файл 7: Таблица S7 [и Дополнительный файл 8 с образцом ключа для инфекции и лечения].Необработанные последовательности общедоступны в общедоступном хранилище EBI под регистрационным номером: PRJEB29134. Наборы метаболомных данных (спектры ЯМР), использованные и/или проанализированные в ходе текущего исследования, можно получить у соответствующего автора по обоснованному запросу.

Сокращения

ЛПВП липопротеинов высокой плотности
ЯМР Ядерный магнитный резонанс
О-PLS Д.А. Ортогональные проекции на латентные структуры дискриминантного анализа
РСА основного компонента Анализ
PM Post Mortl
VLDL
VLDL Очень низкая плотность Липопротеин

Взносы авторов

Исследование было разработано MJW, RMLR и SPC и образцами, собранными CLR.Получение ЯМР, статистика и анализ данных были проведены CLR, секвенирование следующего поколения и аннотация были выполнены RJE. Рукопись была составлена ​​CLR и проверена SPC, MJW, RMLR и RJE. Все авторы прочитали и одобрили рукопись.

Примечания

Утверждение этических норм и согласие на участие

Все процедуры проводились в соответствии с пересмотренным Законом о научных процедурах в отношении животных от 1986 г. в Великобритании и Директивой 2010/63ЕС в Европе, одобренной Агентством по охране здоровья животных и растений (APHA- https //www.gov.uk/government/organisations/animal-and-plant-health-agency/about/research#ethics-committee), а птиц содержали в соответствии с рекомендациями Министерства внутренних дел (лицензия Министерства внутренних дел -PPL 70/7249-). В этом исследовании использовались коммерческие куры-несушки NovoGen Brown, полученные от коммерческого поставщика (Tom Barron Ltd., Великобритания). Все эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями контрольного списка ПРИБЫТИЯ (Дополнительный файл 9).

Согласие на публикацию

Не применимо.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов в отношении этой работы.

Примечание издателя

Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

Ссылки

1. Хупер Л.В., Литтман Д.Р., Макферсон А.Дж. Взаимодействие микробиоты и иммунной системы. Наука. 2012;336(6086):1268–1273. doi: 10.1126/science.1223490. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]2. Лей Р.Е., Тернбо П.Дж., Кляйн С., Гордон Дж.И. Микробная экология: кишечные микробы человека, связанные с ожирением.Природа. 2006; 444:1022. doi: 10.1038/4441022a. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]3. Кани П.Д., Делзенн Н.М. Роль микробиоты кишечника в энергетическом обмене и метаболических заболеваниях. Курр Фарм Дез. 2009; 15:1546–1558. doi: 10.2174/138161209788168164. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]4. Клаус С.П., Эллеро С.Л., Бергер Б., Краузе Л., Бруттин А. и др. Индуцированное колонизацией микробное метаболическое взаимодействие между хозяином и кишечником. МБио. 2011;2:e00271–e00210. doi: 10.1128/mBio.00271-10. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]5.Спор А., Корен О., Лей Р. Раскрытие влияния окружающей среды и генотипа хозяина на микробиом кишечника. Nat Rev Microbiol. 2011;9:279. doi: 10.1038/nrmicro2540. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]6. Антарам В.К., Ли Э., Измаил А., Шарма А., Май В., Рэнд К.Х. и др. Дисбактериоз кишечника и истощение маслянообразующих бактерий при инфекции Clostridium difficile и нозокомиальной диарее. JCM. 2013;51(9):2884–2892. doi: 10.1128/JCM.00845-13. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]7.Schulfer AF, Battaglia T, Alvarez Y, Bijnens L, Ruiz VE, et al. Межпоколенческая передача нарушенной антибиотиками микробиоты усиливает колит у восприимчивых мышей. Нат микробиол. 2018;3:234. doi: 10.1038/s41564-017-0075-5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]8. Le Roy CI, Mappley LJ, La Ragione RM, Woodward MJ, Claus SP. Индуцированный Brachyspira pilosicoli кишечный спирохетоз птиц. Microb Ecol Health Дис. 2015;26:28853. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]9. Мэппли Л.Дж., Ла Раджоне Р.М., Вудворд М.Дж. Brachyspira и ее роль в кишечном спирохетозе птиц. Вет микробиол. 2014; 168: 245–260. doi: 10.1016/j.vetmic.2013.11.019. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 10. Дварс Р.М., Давелаар Ф.Г., Смит Х.Ф. Заражение родительских кур-бройлеров кишечными спирохетами птиц: влияние на яйценоскость и качество цыплят. Авиан Патол. 1993; 22: 693–701. doi: 10.1080/03079459308418957. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11. Поульсен С.М., Карлссон М., Йоханссон Л.Б., Вестер Б. Препараты плевромутилина тиамулин и валнемулин связываются с РНК в пептидилтрансферазном центре на рибосоме.Мол микробиол. 2001;41:1091–1099. doi: 10.1046/j.1365-2958.2001.02595.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 12. Pringle M, Landén A, Unnerstad HE, Molander B, Bengtsson B. Чувствительность к противомикробным препаратам свиней Brachyspira hyodysenteriae и Brachyspira pilosicoli , выделенных в Швеции в период с 1990 по 2010 год. Acta Vet Scand. 2012;54:54. дои: 10.1186/1751-0147-54-54. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]13. Стивенс CP, Хэмпсон DJ. Оценка тиамулина и линкомицина для лечения племенных бройлеров, экспериментально инфицированных кишечной спирохетой Brachyspira pilosicoli .Авиан Патол. 2002; 31: 299–304. doi: 10.1080/03079450220136501. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Burch DGS, Harding C, Alvarez R, Valks M. Лечение полевого случая кишечного спирохетоза птиц, вызванного Brachyspira pilosicoli , тиамулином. Авиан Патол. 2006; 35: 211–216. doi: 10.1080/03079450600711011. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Вудворд М.Дж., Мэппли Л., Ле Рой С., Клаус С.П., Дэвис П. и др. Применение Denagard® Tiamulin в питьевой воде для борьбы с инфекцией Brachyspira pilosicoli птицы-несушки.рез. вет. 2015;103:87–95. doi: 10.1016/j.rvsc.2015.09.015. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Le Roy CI, Passey JL, Woodward MJ, La Ragione RM, Claus SP. Метабономический анализ реакции Brachyspira pilosicoli на тиамулин показывает метаболическую активность, несмотря на значительное торможение роста. Анаэроб. 2017;45:71–77. doi: 10.1016/j.anaerobe.2017.03.018. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Lozupone CA, Stombaugh JI, Gordon JI, Jansson JK, Knight R. Разнообразие, стабильность и устойчивость микробиоты кишечника человека.Природа. 2012;489:220. doi: 10.1038/nature11550. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]18. Родригес Р.Р., Грир Р.Л., Донг Х, Д.Суза К.Н., Гурунг М. и др. Вызванные антибиотиками изменения микробиоты кишечника связаны с изменениями метаболизма глюкозы у здоровых мышей. Фронт микробиол. 2017;8:2306. doi: 10.3389/fmicb.2017.02306. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]19. Li J, Yang K, Ju T, Ho T, McKay CA, et al. Воздействие антибиотиков в раннем возрасте влияет на развитие островков поджелудочной железы и регуляцию метаболизма.Научный доклад 2017; 7: 41778. doi: 10.1038/srep41778. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]20. Детлефсен Л., Релман Д.А. Неполное восстановление и индивидуальная реакция микробиоты дистального отдела кишечника человека на повторное воздействие антибиотиков. ПНАС. 2001; 108 (Приложение 1): 4554–4561. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]21. Агилера М., Серда-Куэльяр М., Мартинес В. Дисбиоз, вызванный антибиотиками, изменяет взаимодействие хозяина и бактерий и приводит к сенсорным и моторным изменениям толстой кишки у мышей. Кишечные микробы.2015; 6:10–23. doi: 10.4161/194.2014.9

. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]22. Стечер Б., Майер Л., Хардт В.Д. «Цветение» в кишечнике: как дисбиоз может способствовать эволюции патогенов. Nat Rev Microbiol. 2013;11:277. doi: 10.1038/nrmicro2989. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Субраманиан С., Хук С., Яцуненко Т., Хак Р., Махфуз М. и др. Стойкая незрелость микробиоты кишечника у детей Бангладеш, страдающих от недоедания. Природа. 2014;510:417. doi: 10.1038/nature13421. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]24.Клаус СП. Борьба с недоеданием: не забывайте об ошибках. Клеточный микроб-хозяин. 2016;13:239–240. doi: 10.1016/j.chom.2013.02.015. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Тремароли В., Бекхед Ф. Функциональные взаимодействия между микробиотой кишечника и метаболизмом хозяина. Природа. 2012; 489:242. doi: 10.1038/nature11552. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 26. Кокс Л.М., Яманиши С., Сон Дж., Алексеенко А.В., Леунг Дж.М. и соавт. Изменение кишечной микробиоты во время критического окна развития имеет длительные метаболические последствия.Клетка. 2014; 158:705–721. doi: 10.1016/j.cell.2014.05.052. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]27. Мэппли Л.Дж., Чоржевска М.А., Кули В.А., Вудворд М.Дж., Ла Раджоне Р.М. Лактобациллы препятствуют росту, подвижности и прикреплению Brachyspira pilosicoli : потенциальное вмешательство против птичьего кишечного спирохетоза. АЕМ. 2011;77(15):5402–5411. doi: 10.1128/AEM.00185-11. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]28. Нареш Р., Хэмпсон DJ. Аттракцион Brachyspira pilosicoli к муцину.Микробиология. 2010; 156:191–197. doi: 10.1099/микрофон 0.030262-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Мэппли Л.Дж., Блэк М.Л., Абуун М., Дарби А.С., Вудворд М.Дж. и др. Сравнительная геномика штаммов Brachyspira pilosicoli : геномные перестройки, редукция и корреляция генетического комплемента с фенотипическим разнообразием. Геномика BMC. 2012;13:454. дои: 10.1186/1471-2164-13-454. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]31. Mappley LJ, Tchórzewska MA, Nunez A, Woodward MJ, Bramley PM, et al.Пероральное лечение цыплят Lactobacillus reuteri LM1 снижает патологию, индуцированную Brachyspira pilosicoli . ДжММ. 2013; 62: 287–296. [PubMed] [Google Scholar] 32. Хосрави Ю., Бунте Р.М., Чиоу К.Х., Тан Т.Л., Вонг В.Ю. и др. Helicobacter pylori и микробиота кишечника модулируют энергетический гомеостаз, прежде чем вызвать гистопатологические изменения у мышей. Кишечные микробы. 2016;7:48–53. doi: 10.1080/194.2015.1119990. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]33.Фелицкий Д.Дж., Кэннон Дж.Г., Капп М.В., Хонг Дж., Ван Винсберг А.В. и др. Исключение бетаина глицина с поверхности анионного биополимера: почему бетаин глицина является эффективным осмопротектором, но также и совместимым растворенным веществом. Биохимия. 2004;43:14732–14743. дои: 10.1021/bi049115w. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 34. Крейг С.А. Бетаин в питании человека. Am J Clin Nutr. 2004; 80: 539–549. doi: 10.1093/ajcn/80.3.539. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 35. Кушваха Р.С., Льюис Д.С., Кэри К.Д., JrHC MG. Влияние эстрогена и прогестерона на липопротеины плазмы и экспериментальный атеросклероз у павианов ( Papio sp. ) Тромб атеросклероза. 1991; 11: 23–31. doi: 10.1161/01.ATV.11.1.23. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 36. Судья С.М., Чаттертон РТ. Прогестерон-специфическая стимуляция биосинтеза триглицеридов в клеточной линии рака молочной железы (T-47D) Cancer Res. 1983; 43:4407–4412. [PubMed] [Google Scholar] 37. Сакс FM, Уолш Б.В. Влияние половых гормонов на липопротеины сыворотки крови: нерешенные вопросы биологии и клинической практики. Энн Н.Ю. Академия наук. 1990; 592: 272–285. doi: 10.1111/j.1749-6632.1990.tb30339.Икс. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 38. Нацухори М., ван Раак М., Лигтенберг М., Клей Л., тен Берге Д. и др. Выделение последовательности кДНК полноразмерного цитохрома P450 (CYP3A) крупного рогатого скота и ее функциональная экспрессия в клетках V79. Environ Toxicol Pharmacol. 1997; 3:17–24. doi: 10.1016/S1382-6689(96)00133-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 39. Бертилссон Г., Хайдрих Дж., Свенссон К., Осман М., Джендеберг Л. и др. Идентификация ядерного рецептора человека определяет новый сигнальный путь для индукции CYP3A.ПНАС. 1998;95:12208–12213. doi: 10.1073/pnas.95.21.12208. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]40. Лемли К.О., Батлер С.Т., Батлер В.Р., Уилсон М.Э. Инсулин изменяет катаболические ферменты прогестерона в печени цитохрома Р450 2С и 3А у молочных коров. JDS. 2008; 91: 641–645. [PubMed] [Google Scholar]41. Виткамп Р.Ф., Неймейер С.М., Ван Мирт А.С. Образование комплекса цитохрома Р-450 в печени крыс под действием антибиотика тиамулина. Противомикробные агенты Chemother. 1996;40:50–54. doi: 10.1128/AAC.40.1.50. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]42.Де Гроен Э.М., Неймейер С.М., Хорбах Г.Дж., Виткамп Р.Ф. Тиамулин ингибирует активность CYP3A4 человека в клеточной линии NIH/3T3, стабильно экспрессирующей кДНК CYP3A4. Биохим Фармакол. 1995; 50: 771–773. doi: 10.1016/0006-2952(95)00197-8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]43. Zweers-Zeilmaker WM, Van Miert AS, Horbach GJ, Witkamp RF. Комплексообразование in vitro и ингибирование активности цитохрома Р450 печени различными макролидами и тиамулином у коз и крупного рогатого скота. рез. вет. 1999; 66: 51–55. doi: 10.1053/rvsc.1998.0239. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]44. Ratz V, Laczay P, Mora ZS, Csiko GY, Monostori K, et al. Недавние исследования влияния тиамулина и монензина на активность цитохрома Р450 в печени у кур и индеек. J Vet Pharmacol Ther. 1997; 20: 415–418. doi: 10.1046/j.1365-2885.1997.00092.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]45. Муссо Г., Гамбино Р., Кассадер М. Взаимодействия между микробиотой кишечника и метаболизмом хозяина, предрасполагающие к ожирению и диабету. Анну Рев Мед. 2011;62:361–380. дои: 10.1146/аннурев-мед-012510-175505. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]46. Эверард А., полицейский Кани. Сахарный диабет, ожирение и микробиота кишечника. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2013; 27:73–83. doi: 10.1016/j.bpg.2013.03.007. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]47. Ларсен Н., Вогенсен Ф.К., ван ден Берг Ф.В., Нильсен Д.С., Андреасен А.С. и соавт. Микробиота кишечника у взрослых людей с диабетом 2 типа отличается от таковой у взрослых без диабета. ПЛОС Один. 2010;5:e9085. doi: 10.1371/journal.pone.0009085. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]48.Чо И., Яманиши С., Кокс Л., Мете Б.А., Завадил Дж. и др. Антибиотики в раннем возрасте изменяют микробиом толстой кишки мышей и ожирение. Природа. 2012; 488:621. doi: 10.1038/nature11400. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]49. Trasande L, Blustein J, Liu M, Corwin E, Cox LM, et al. Воздействие антибиотиков на младенцев и масса тела в раннем возрасте. Инт Дж. Обес. 2013;37:16. doi: 10.1038/ijo.2012.132. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]50. Ley RE, Bäckhed F, Turnbaugh P, Lozupone CA, Knight RD, et al.Ожирение изменяет микробную экологию кишечника. ПНАС. 2005; 102:11070–11075. doi: 10.1073/pnas.0504978102. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]51. Тернбо П.Дж., Лей Р.Е., Маховальд М.А., Магрини В., Мардис Э.Р. и др. Связанный с ожирением кишечный микробиом с повышенной способностью собирать энергию. Природа. 2006; 444:1027. doi: 10.1038/nature05414. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]52. Перейра Д.И., Гибсон Г.Р. Ассимиляция холестерина молочнокислыми бактериями и бифидобактериями, выделенными из кишечника человека.Appl Environ Microbiol. 2002; 68: 4689–4693. doi: 10.1128/AEM.68.9.4689-4693.2002. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]53. Джин Л.З., Хо Ю.В., Абдулла Н., Джалалудин С. Показатели роста, кишечные микробные популяции и уровень холестерина в сыворотке бройлеров, получавших рацион, содержащий культур Lactobacillus . Poult Sci. 1998; 77: 1259–1265. doi: 10.1093/ps/77.9.1259. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]54. Мэппли Л.Дж., Чоржевска М.А., Нуньес А., Вудворд М.Дж., Ла Рагионе Р.М. Доказательства системного распространения потенциально зоонозной кишечной спирохеты Brachyspira pilosicoli у экспериментально зараженных кур-несушек.J Med Microbiol. 2013; 62: 297–302. doi: 10.1099/jmm.0.052126-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]55. Le Roy CI, Mappley LJ, La Ragione RM, Woodward MJ, Claus SP. Метаболическая характеристика куриных тканей и биожидкостей на основе ЯМР: модель для исследования птиц. Метаболомика. 2016;12:157. doi: 10.1007/s11306-016-1105-7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]56. Эллис Р.Дж., Брюс К.Д., Дженкинс С., Стотард Дж.Р., Аджарова Л. и др. Сравнение микробиоты дистального отдела кишечника людей и животных в Африке.ПЛОС Один. 2013;8:e54783. doi: 10.1371/journal.pone.0054783. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]58. Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, Bittinger K, Bushman FD, et al. QIIME позволяет анализировать данные секвенирования с высокой пропускной способностью. Нат Методы. 2010;7:335. doi: 10.1038/nmeth.f.303. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]59. Гаваган С.Л., Уилсон И.Д., Николсон Дж.К. Физиологическая вариация в метаболическом фенотипировании и функциональных геномных исследованиях: использование коррекции ортогонального сигнала и PLS-DA.ФЭБС лат. 2002; 530:191–196. doi: 10.1016/S0014-5793(02)03476-2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Лечение антибиотиками вызывает дисбактериоз кишечника и модулирует метаболизм в куриной модели желудочно-кишечной инфекции

BMC Vet Res. 2019; 15: 37.

,

, 1, 2 ,
2 , 1 , 3 , , 3 , 4 1

0 1

Caroline Ivanne Le Roy

1 Департамент пищевых и пищевых наук, University of Reading, Whiteknights, Reading, RG6 6AP UK

2 Текущий адрес: Департамент исследований близнецов и генетической эпидемиологии, King’s College London, London, SE1 7EH UK

Martin John Woodward

1 Департамент пищевых продуктов и Науки о питании, Университет Рединга, Уайтнайтс, Рединг, RG6 6AP UK

Richard John Ellis

3 Центральный отдел секвенирования, Агентство по охране здоровья животных и растений, Addlestone, Surrey, KT15 3NB UK

Roberto Marcello La Ragione

2 4 Факультет здоровья и медицинских наук, Школа ветеринарной медицины, Университет Суррея, Гилфорд, Суррей, GU2 7AL UK

Sandrine Paule Claus

1 Факультет наук о пищевых продуктах и ​​питании, Университет Рединга, Уайтнайтс, Рединг, RG6 6AP UK

1 Департамент наук о пищевых продуктах и ​​питании, Университет Рединга, Уайтнайтс, Рединг, RG6 6AP UK

2 Настоящее время Адрес: Департамент исследований близнецов и генетической эпидемиологии, Королевский колледж Лондона, Лондон, SE1 7EH UK

3 Центральный отдел секвенирования, Агентство здоровья животных и растений, Addlestone, Surrey, KT15 3NB UK

4 Факультет здравоохранения и Медицинские науки, Школа ветеринарной медицины, Университет Суррея, Гилфорд, Суррей, GU2 7AL UK

Автор, ответственный за переписку.

Поступила в редакцию 14 сентября 2018 г.; Принято 21 декабря 2018 г.

Открытый доступ Эта статья распространяется в соответствии с условиями международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что вы укажете автора(ов) оригинала и источник, предоставите ссылку на лицензию Creative Commons и укажете, были ли внесены изменения. Отказ от права Creative Commons на общественное достояние (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) относится к данным, доступным в этой статье, если не указано иное. Эта статья цитировалась в других статьях в PMC.
Дополнительные материалы

Дополнительный файл 1: Инфекция изменяет метаболическую активность ГМ и содержание полисахаридов в просвете кишечника. (A) Баллы OPLS-DA по сравнению с перекрестно подтвержденными баллами, рассчитанными с использованием спектров фекальной воды групп A и B в PM2 и инфекции в качестве предиктора. (B) График загрузки, связанный с моделью OPLS-DA, описанной в A.(EPS 14763 kb)

GUID: 637A03F0-C80E-4205-91CF-62195461F463

Дополнительный файл 2: Уровень бетаина в плазме при PM2 для всех групп, A: контрольная, B: инфицированные, C: инфицированные и получавшие лечение ( 62 ppm), D: инфицированные и пролеченные (125 ppm), E: инфицированные и пролеченные (250 ppm). * pv < 0,05; ** pv < 0,01. (EPS 614 КБ)

GUID: 4147F990-2E35-44CF-9D0F-E210F590E478

Дополнительный файл 3: Уровень глюкозы в плазме при PM2 для всех групп, A: контроль, B: инфицированные, C: инфицированные и получавшие лечение (62 D: инфицированные и пролеченные (125 ppm), E: инфицированные и пролеченные (250 ppm).* pv < 0,05; ** pv < 0,01. (EPS 601 kb)

GUID: A8EC82A4-CC5F-4CA2-B276-BB70050B5A57

Дополнительный файл 4: Линейный ответ плазмы на лечебную дозу тиамулина. (A) График оценок в сравнении с перекрестно подтвержденными оценками регрессионной модели O-PLS, рассчитанными с использованием спектров H-ЯМР 1 птиц в PM2 в качестве матрицы независимых переменных и доз тиамулина в качестве предиктора. Параметры модели: R 2 Y = 0,48, Q 2 Y = 0,43 и p -значение = 0.01 (EPS 13970 kb)

GUID: 6ABCB568-5DB8-4C8B-A3E5-E06A18F2EDEA

Дополнительный файл 5: Относительная численность OTU спирохет в процентах для каждой лечебной группы в ходе исследования. (EPS 948 КБ)

GUID: 6204AE20-8C5E-4D76-B50E-F36A367FD54A

Дополнительный файл 6: Переменная. А, нагрузки ПК1. B, Загрузка ПК2.(EPS 2121 КБ)

GUID: 5CE26145-34C9-428F-A47D-5808CAFBF10B

Дополнительный файл 7: Таблица S7 . Таблица количества необработанных чтений OTU. (CSV 3322 КБ)

GUID: 58B61D3D-DD60-4F43-A35F-D47A593AF3EA

Дополнительный файл 8: Таблица S8 . Пример ключа и метаданных для дополнительного файла 7: таблица S7. (CSV, 2 КБ)

GUID: E93301B8-46A1-4F6B-BBDA-2B41D7B09EC1

Дополнительный файл 9: Дополнительный материал S9. чек-лист ПРИБЫТИЯ. (PDF, 1067 КБ)

GUID: 8BC7A496-0DC5-45E7-B489-E0D0C6C1AC58

Заявление о доступности данных

S7 [и Дополнительный файл 8 с образцом ключа для заражения и лечения].Необработанные последовательности общедоступны в общедоступном хранилище EBI под регистрационным номером: PRJEB29134. Наборы метаболомных данных (спектры ЯМР), использованные и/или проанализированные в ходе текущего исследования, можно получить у соответствующего автора по обоснованному запросу.

Abstract

История вопроса

Заражение пищеварительного тракта желудочно-кишечными патогенами приводит к развитию симптомов от легкой диареи до более тяжелых клинических признаков, таких как дизентерия, сильное обезвоживание и, возможно, смерть.Хотя антибиотики эффективны для борьбы с инфекциями, они также вызывают дисбактериоз, который, как предполагается, приводит к изменению прибавки в весе в системах животноводства.

Результаты

Это первое исследование, демонстрирующее метаболическое влияние инфекции желудочно-кишечного тракта ( Brachyspira pilosicoli ) и его устранение с помощью лечения антибиотиками (тиамулин) на системный метаболизм хозяина (курицы) и состав кишечной микробиоты с использованием спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения 1 H и секвенирование нового поколения 16S рДНК (NGS).Были идентифицированы четкие системные метаболические маркеры инфекций, такие как глицерин и бетаин. Потеря веса у нелеченых животных частично объяснялась наблюдением модификации системного энергетического метаболизма хозяина, характеризующейся использованием глицерина в качестве предшественника глюкозы. Тем не менее, лечение антибиотиками вызвало повышение соотношения ЛПОНП/ЛПВП в плазме, что может способствовать уменьшению потери веса, наблюдаемой у обработанных птиц. Все метаболические реакции сопровождались значительным сдвигом микробиоты при инфекции или лечении антибиотиками.

Заключение

Это исследование показывает, что инфекция и лечение антибиотиками вызывают дисбактериоз, который может повлиять на системный энергетический метаболизм хозяина и вызвать изменения фенотипа и состояния здоровья.

Электронный дополнительный материал

Электронная версия этой статьи (10.1186/s12917-018-1761-0) содержит дополнительные материалы, доступные авторизованным пользователям.

Ключевые слова: Микробиота, метаболизм, антибиотик, энергия, дисбиоз

Предыстория

Известно, что состав кишечной микробиоты (ГМ) оказывает сильное влияние на здоровье хозяина посредством широкого спектра механизмов, начиная от контроля иммунных функций [1], метаболических гомеостаз [2, 3] и метаболизм лекарственных средств [4].Даже если в целом стабильный внутри вида состав GM сильно зависит от воздействия окружающей среды (питание, ксенобиотики и инфекции), и любая модификация этой экосистемы может повлиять на здоровье хозяина, изменяя симбиотические отношения, существующие между хозяином и его кишечными микробами [5]. . Например, присутствие условно-патогенного микроорганизма в пищеварительном тракте может протекать бессимптомно, но также вызывать серьезные нарушения здоровья. Кроме того, инфекция, как правило, связана с бактериальным дисбиозом в пищеварительном тракте [6], но влияние такой модификации на метаболизм хозяина и развитие таких симптомов, как потеря веса, до сих пор плохо изучено.Улучшение симптомов обычно наблюдается после лечения антибиотиками за счет уменьшения количества патогенных бактерий и уменьшения последствий их инфекции. Однако использование антибиотиков также связано с уменьшением разнообразия GM, что связано с дальнейшим ослаблением метаболизма хозяина [7].

Кишечный спирохетоз птиц (ККИ) вызывается колонизацией нижних отделов пищеварительного тракта птиц возбудителем Brachyspira pilosicoli (тип Spirochaetes; класс Spirochaetes; отряд Spirochaetales; семейство Bracyspiraceae) [8, 9].Бактерия прикрепляется к клеточной стенке и может вызвать диарею, связанную со снижением скорости роста и производства яиц [10]. Наиболее распространенным средством, используемым для борьбы с инфекцией, является тиамулин™, антибиотик семейства плевромутилина, который ингибирует синтез белка путем связывания с 50S-областью рибосомы [11, 12]. Лишь несколько исследований оценили его эффективность у цыплят, несмотря на его интенсивное использование для лечения птичьих стад в промышленности [13, 14]. На сегодняшний день это заболевание и его лечение мало изучены и остаются малоизученными.Действительно, причина таких симптомов, как потеря веса и снижение яйценоскости, до сих пор неясна. В недавнем исследовании [15] была оценена эффективность трех доз Тиамулина™ для лечения кур-несушек, перорально зараженных B. pilosicoli B2904, и было установлено, что инфекция была связана со снижением скорости роста и что птицы, получавшие Тиамулин™, выздоравливали от инфекции независимо от использованной дозы, в то время как поддержание массы тела наблюдалось только в ответ на две самые высокие дозы. Кроме того, Тиамулин™ значительно уменьшал другие симптомы, связанные с инфекцией, а также системное распространение B.пилосиколи . Тем не менее, через три недели после прекращения лечения антибиотиками все еще наблюдалась колонизация пищеварительного тракта возбудителем. Таким образом, мы пришли к выводу, что это исследование представляет собой интересную модель инфекции для понимания реакции системного метаболизма и микробиоты кишечника хозяина на колонизацию пищеварительного тракта патогеном. Кроме того, план эксперимента позволяет проводить продольное исследование влияния лечения антибиотиками на суперорганизм (то есть на хозяина и микробиоту его кишечника).В этой статье мы представляем результаты, полученные после анализа образцов биопсии и биожидкости, собранных в ходе предыдущего исследования [15]. Для оценки системного метаболического ответа хозяина на инфекцию и лечение антибиотиками мы использовали метаболомику на основе 1 Н-ЯМР, которая позволяет нецелевую оценку метаболических колебаний, происходящих в биологических системах. Поскольку микробиота кишечника неразрывно связана с метаболическими реакциями хозяина, ее состав в ответ на инфекцию и лечение контролировали с помощью секвенирования гена 16S рРНК (16S NGS).Оба анализа позволили по-новому взглянуть на влияние инфекции и лечения антибиотиками на здоровье хозяина, объяснив физиологическую реакцию как на бактериальное, так и на химическое воздействие.

Результаты

Инфекция и лечение антибиотиками влияют на рост и яйценоскость

Влияние инфекции и яйценоскости отслеживали на протяжении всего исследования во всех группах (A, контрольная; B только инфицированные; CE, инфицированные и получавшие Тиамулин™ от самой низкой до максимальная доза). Заражение B.pilosicoli приводил к значительному снижению скорости роста (рис. б), но к концу исследования цыплята из группы Б (зараженные) весили меньше, чем птицы из группы А (контроль), но этот результат не был значимым. Две самые высокие дозы Тиамулина™ (группа D и E) были способны поддерживать рост цыплят, поскольку к концу исследования птицы из этих двух групп имели более высокий вес, чем в контрольной группе, и этот показатель был значительно выше, чем в инфицированной группе ( p -значение < 0.05). Однако у животных, получавших самую низкую дозу (группа C), средний вес в конце исследования был аналогичен весу инфицированной группы (B) и значительно отличался от трех других (A, D и E). . Это предполагает, что только более высокие дозы антибиотиков связаны с поддержанием скорости роста во время инфекции.

Экспериментальный план ( a ) и масса тела птицы ( b )

Инфекция вызывает системный метаболический ответ хозяина

Системный метаболический ответ на инфекцию B.pilosicoli наблюдали сразу после окончания периода заражения (день 6). O-PLS-DA показал, что инфекция была связана с модификацией метаболомов почек, печени, селезенки и плазмы (рис. a, b, c и d). Печень инфицированных птиц была богаче глицерином, лактатом, холином, сукцинатом и ацетатом (рис. а). В селезенке инфекция привела к снижению O -фосфохолина, глутамина и АМФ и повышению уровня глицерина, урацила, цитидина и лейцина (рис. б). В почках инфекция вызывала увеличение содержания глицерина, урацила и ксантина при одновременном снижении содержания инозина (рис.в). Повышенное содержание бетаина и глицерина также было связано с инфекцией в плазме (рис. d). После заражения (PM1) содержимое толстой кишки инфицированных птиц было богаче полисахаридами и аминокислотами (дополнительный файл 1). Через две недели после окончания периода заражения (PM2) почки, печень и селезенка инфицированных, но не леченых птиц восстановили свой метаболический гомеостаз (больше не было обнаруживаемых метаболических различий между контрольной и любой другой группой), что указывает на отсутствие метаболические изменения наблюдались в ответ на инфекцию.Однако уровень глюкозы в плазме зараженных птиц снизился (рис. д) примерно на 50%.

Инфекция B. pilosicoli связана с основными изменениями системного метаболизма. a Графики баллов (правая панель) и нагрузки (левая панель) модели O-PLS-DA, рассчитанные с использованием спектров 1D-ЯМР печени птиц при PM1 в качестве матрицы независимых переменных и инфекции в качестве предиктора инфицированных птиц (красный квадрат) и неинфицированные птицы (синий кружок). Форма графиков нагрузки представляет собой среднее стандартное отклонение всех спектров ЯМР, полученных для данной модели, и умноженное на вес модели O-PLS DA, что позволяет визуализировать, связаны ли метаболиты с инфекцией положительно (указывая вниз) или отрицательно (указывая вверх).Цветовая шкала представляет уровень корреляции между каждой точкой данных и заражением. b То же для селезенки. c то же для почки. d то же для плазмы. e То же для плазмы на Т1

В подвздошной, толстой и слепой кишках и поджелудочной железе на протяжении всего исследования не наблюдалось значительных метаболических изменений в ответ на инфекцию.

К концу исследования дифференцировать метаболически инфицированных птиц от неинфицированных не удалось.

Лечение Тиамулином™ ослабляет метаболический ответ на инфекцию

Затем мы исследовали, модулирует ли Тиамулин™ метаболический ответ хозяина на инфекцию. На PM2 в ответ на инфекцию наблюдался более высокий уровень бетаина в плазме ( p — значение < 0,01 - Дополнительный файл 2). Однако у птиц, инфицированных и обработанных тиамулином™, уровень бетаина в плазме был таким же, как и у контрольной группы, хотя этот ответ не зависел от дозы.

В предыдущем разделе было описано, что инфекция вызывает падение уровня глюкозы в куриной плазме ( p -значение < 0.05 – Тест Уилкоксона-) в PM2, который частично облегчался лечением тиамулином™. Это не было полностью исправлено лечением тиамулином™, так как снижение уровня глюкозы в плазме все же было ниже, чем в контрольной группе ( p -значение < 0,05). Интересно, что уровни глюкозы в плазме были обратно пропорциональны дозе лечения (дополнительный файл 3).

Терапия тиамулином вызывает значительный сдвиг в метаболизме липидов

График PCA, показывающий общее влияние лечения на метаболические профили плазмы на PM2 (рис.а) выявили четкое разделение между оценками птиц, получавших Тиамулин™, и птиц, не получавших основного компонента 1 (ПК1). Действительно, множество птиц, получавших антибиотики, занимали метаболическое пространство, отличное от контрольных и инфицированных, но нелеченных птиц. Метаболические профили плазмы цыплят, получавших Тиамулин™, характеризовались повышенным уровнем липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) и сниженным уровнем липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) (рис. а, б и в). Линейная регрессия метаболических профилей в зависимости от дозы антибиотиков показала, что влияние на липопротеины зависело от дозы (дополнительный файл 4).

Тиамулин вызывает изменения метаболизма в плазме. график баллов PCA для первого (T1 48%) и четвертого (T4 5%) основных компонентов, полученный из модели, рассчитанной с использованием спектров 1d-ЯМР плазмы птиц при PM2. b Цветной график спектров 1D-ЯМР плазмы контрольных птиц (синий), инфицированных и необработанных птиц (розовый) и обработанных птиц (зеленый). c График загрузки основного компонента 1 (PC1), молекулы, направленные вверх, положительно коррелируют с PC1, молекулы, направленные вниз, отрицательно коррелируют с PC1. d График загрузки основного компонента 4 (PC4), молекулы, направленные вверх, положительно коррелируют с PC4, молекулы, направленные вниз, отрицательно коррелируют с PC4. e График показателей PCA, полученный на основе модели, рассчитанной с использованием спектров ЯМР 1 H HR-MAS, полученных из биоптатов интактной печени. f График нагрузок основного компонента 1 (PC1) модели PCA, представленной в E

Поскольку печень является центральным органом, регулирующим метаболизм холестерина и липидов, метаболические профили интактных биоптатов печени были созданы с использованием HR-MAS 1 Н-ЯМР спектроскопия.Этот анализ показал, что печень птиц, получавших Тиамулин™, была богаче липопротеинами, чем птицы, не получавшие лечения (рис. c и f), что свидетельствует о том, что печень секретировала больше ЛПОНП, и подтверждает влияние Тиамулина™ на центральный метаболизм липидов и холестерина.

Тиамулин™ ускоряет постпубертатный метаболический сдвиг

При изучении влияния тиамулина™ на метаболические профили плазмы цыплят в общем исследовании (все группы PM1, 2 и 3) выяснилось, что возраст также является сильным источником метаболических нарушений. вариация (рис.). Действительно, линейная регрессия, рассчитанная по метаболическим профилям плазмы с использованием возраста в качестве предиктора, показала хорошую модель, на что указывают сильные параметры (R 2 Y = 0,52, Q 2 Y = 0,51 и p -значение = 0,002). . Возраст птицы ассоциировался со снижением уровня ЛПВП, глюкозы, сукцината и лактата, в то время как уровень ЛПОНП повышался (рис. ). Анализ показателей (рис. b) показал, что птицы, получавшие тиамулин™, были метаболически сходны с птицами в постпубертатном периоде (PM3 = 19 недель) на PM2 (= 17 недель) и, наоборот, у нелеченных птиц метаболические профили были сходны с птицами. из препубертатной группы (PM1 = 16 недель).

Возраст связан с повышением ЛПОНП и снижением ЛПВП и уровня глюкозы. a Цветной график спектров 1D-ЯМР плазмы 16-недельных птиц (синий), 17-недельных птиц (красный) и 19-недельных птиц (черный). b График показателей регрессионной модели O-PLS, рассчитанных с использованием 1 H-ЯМР-спектров птиц во все моменты времени в качестве матрицы независимых переменных и возраста птиц в качестве предиктора. c График коэффициента регрессии O-PLS в зависимости от возраста птицы

Инфекция и Тиамулин™ изменили состав микробиоты слепой кишки

Состав популяции микробиоты слепой кишки был оценен в ответ на инфекцию и лечение Тиамулином™ с использованием 454 16S пиросеквенирования V4 -V5 гипервариабельные области.Популяция микробиоты слепой кишки была стабильной с течением времени в контрольной группе, как показано на графиках оценки PCA (рис. a–c и дополнительный файл 5).

Лечение тиамулином способствует глубокому изменению микробного разнообразия и популяции кишечника. a Графики показателей PCA, рассчитанные с использованием относительного процента численности бактерий на уровне семейства для всех птиц, но отображающие только показатели ( n  = 8) контрольных (синий кружок) и инфицированных птиц (розовый квадрат) после заражения (T0) . b Тот же график оценок PCA, что и для A, но отображающий только оценки ( n  = 8) контрольной группы (синий кружок), инфицированных птиц (розовый квадрат) и птиц, получавших самую высокую дозу (зеленые треугольники) после лечения (T1). c Тот же график оценки PCA, что и для A и B, но отображающий только оценки контрольной (синий кружок), зараженной птицы (розовый квадрат) и обработанной птицы (зеленые треугольники) через три недели после обработки (T2). d Альфа-разнообразие рассчитано для контрольных, инфицированных и обработанных птиц независимо от времени. e Круговая диаграмма, показывающая относительную численность бактерий на уровне типа для каждой группы (контрольная, инфицированная и получавшая лечение) для трех моментов времени, выбранных в этом исследовании

Инфекция была связана с модификацией комменсальной микробиоты слепой кишки по сравнению с контролем (рис. а и б), но к концу исследования баланс сообщества восстановился (рис. в). Эта модификация микробиоты слепой кишки в основном была связана с увеличением количества Lactobacillales, Burkholderiales и Campylobacterales, причем эти два последних порядка относятся к типу Proteobacteria (дополнительный файл 6).

После лечения Тиамулином™ класс Spirochaetes, к которому принадлежит B. pilosicoli , больше не обнаруживался с помощью подходов секвенирования 16S (рис. e). Тем не менее, этот класс бактерий снова появился через три недели после окончания лечения тиамулином™. Кроме того, в предыдущей публикации было показано, что при использовании более целенаправленных методов B. pilosicoli обнаруживались в каждой инфицированной группе на протяжении всего исследования [15]. Их относительный процент численности был выше, чем в обеих необработанных группах (до 25%), что, вероятно, связано с переходом бактерий в состояние покоя при лечении Тиамулином™ [16].

Используя MANOVA, мы заметили, что α-разнообразие в значительной степени связано с возрастом ( p -значение = 0,047) и лечением ( p -значение = 0,001), а также с взаимодействием между обоими факторами возраст*лечение (p-значение = 7,1*10 − 5 ). Как и ожидалось, дозировка антибиотика была связана с сильным снижением бактериального α-разнообразия по сравнению с контрольной и инфицированной группами на PM2 (значение p = 0,007 и 4,8*10 – 4 соответственно, рис. d). Однако к концу исследования α-разнообразие группы, получавшей лечение, было эквивалентно двум другим группам в тот же момент времени.Лечение тиамулином™ привело к значительному изменению β-разнообразия микробного сообщества слепой кишки (рис. b и дополнительный файл 5). Это было вызвано снижением относительной численности Firmicutes (с 30 до 22%) и увеличением доли Bacteroidetes (с 60 до 71%). Соотношение Firmicutes/Bacteroidetes было изменено приблизительно с 1:2 до 1:3. Хотя микробное разнообразие развивалось в течение трех недель после лечения Тиамулином™, оно не смогло вернуться к исходному составу к концу исследования и продолжало содержать относительно высокое относительное количество протеобактерий (рис.б и в).

Обсуждение

Несмотря на то, что было опубликовано несколько исследований [17–20], мало что известно о взаимосвязи между устойчивостью кишечной микробиоты при кишечных заболеваниях, ее восстановлением после лечения антибиотиками и общим влиянием на метаболизм хозяина. пробел в знаниях, который мотивировал это исследование. Желудочно-кишечные инфекции часто вызывают дисбактериоз микробиоты кишечника, как и лечение антибиотиками [21, 22]. Известно, что состав кишечной микробиоты играет важную роль в росте хозяина, а тяжелый дисбактериоз может быть причиной аномального развития [23, 24].Мы определили, что интервенционное исследование, направленное на оценку эффективности Тиамулина™ против АИС [15], позволит нам оценить, вызвано ли снижение скорости роста, связанное с инфекцией, дисбактериозом микробиоты слепой кишки. Мы предположили, что модификации кишечной микробиоты в результате инфекции приведут к модулированию метаболического гомеостаза хозяина, который был скорректирован в этом исследовании с помощью лечения тиамулином™. Материалы, используемые для этой статьи, были взяты из исследования, которое показало значительное снижение темпов роста среди других клинических последствий у кур-несушек в ответ на B.pilosicoli [15].

Инфекция привела к увеличению количества протеобактерий, многие из которых являются условно-патогенными микроорганизмами, связанными с повышенным риском диареи. Интересно, что обогащение Proteobacteria было связано с метаболическим синдромом [25]. Увеличение протеобактерий ранее наблюдалось в ответ на пенициллин у мышей, что было связано с увеличением массы тела, процента жировой массы и заболеваемостью диабетом [26].

В настоящем исследовании инфекция и бактериальный дисбиоз сопровождались глубокими системными метаболическими изменениями хозяина.Ряд пораженных инфекцией тканей (печень, селезенка, почки и плазма) свидетельствует о системной метаболической реакции организма на колонизацию и дисбактериоз. Интересно, что повышенные уровни глицерина были заметны во всех вышеупомянутых компартментах. Системное повышение уровня глицерина является маркером липолиза в жировых тканях, где триглицериды лизируются на свободные жирные кислоты и глицерин под действием ферментов липазы. Затем глицерин высвобождается в общий кровоток для использования в качестве предшественника глюкозы в печени и/или почках.Этот механизм обычно активируется длительным низким уровнем глюкозы в плазме. Кроме того, желудочно-кишечная инфекция может нарушать всасывание глюкозы из-за нарушения кишечного барьера, и, таким образом, возможно, что это явление также было вызвано снижением всасывания глюкозы в кишечнике. Известно, что B. pilosicoli сильно разрушает стенку кишечника [27], что также подтверждается наблюдением более высоких уровней глюкозы в фекалиях инфицированных птиц. Повышенное содержание полисахаридов в фекалиях также может быть связано со способностью B.pilosicoli для деградации муцина [28–30]. Кроме того, одновременное увеличение содержания бутирата и ацетата, наблюдаемое во время инфекции, свидетельствует о более высокой ферментации углеводов и, следовательно, об изменении метаболической активности ГМ. Концентрация глюкозы в плазме строго контролируется и регулируется, поскольку ее уровень необходимо поддерживать для поддержания основных функций, таких как мозговая и мышечная активность. Для поддержания уровня глюкозы глюконеогенез из глицерина активируется во время голодания, что требует накопления жира для высвобождения неэтерифицированных жирных кислот и глицерина в плазме.Это уменьшение жировой массы, вероятно, связано со снижением скорости роста, наблюдаемым у цыплят, колонизированных B. pilosicoli [15, 31]. Однако падение уровня глюкозы в плазме, наблюдаемое на PM2 после восстановления уровня глицерина, предполагает, что этот альтернативный метаболический путь не может поддерживать потребность в энергии в течение длительного времени.

Полное восстановление метаболического гомеостаза хозяина в ответ на инфекцию было достигнуто в конце исследования (PM3). Это совпало с чистым снижением процента инфицированных птиц во всех группах [15] и стабилизацией микробиоты слепой кишки.Следовательно, симптомы и заметные метаболические реакции хозяина на инфекцию возникали только при наличии дисбактериоза микробиоты. Такое наблюдение предполагает, что как присутствие патогена, так и модификация микробного сообщества кишечника необходимы для запуска метаболических реакций хозяина. Идея о том, что GM может действовать как буфер, регулирующий метаболический ответ хозяина на инфекцию патогеном, была частично исследована Khosravi et al. [32], которые показали, что инфекция Helicobacter pylori вызывала более сильный метаболический ответ хозяина (модификация уровней инсулина, грелина и лептина) у стерильных мышей, чем у обычных животных, и что вызванное инфекцией снижение скорости роста наблюдалось только в отсутствие ГМ.Эта толерантность к патогену была связана с тренировкой иммунной системы. Таким образом, инфекцию можно рассматривать как реакцию на изменение экосистемы, а не на колонизацию одним патогеном.

В этом наборе результатов Тиамулин™ был способен снижать индуцированный инфекцией метаболический ответ, повышать уровень бетаина и снижать уровень глюкозы в плазме. Хотя доза-эффект наблюдался на уровне инфекции, измеренном положительными мазками [15], это не было верно для уровней бетаина в плазме.Вероятно, повышение уровня бетаина в ответ на инфекцию связано с центральной осмопротекторной ролью этой молекулы [33]. Бетаин ранее использовался в качестве пищевой добавки для цыплят из-за его способности защищать кишечный барьер от патогенов, таких как Coccidia [34]. Действительно, инвазия клеток B. pilosicoli вызывает отек и нарушение осмотического баланса [9, 27]. Таким образом, повышенное количество бетаина (обычно поступающего из почек) может транспортироваться из других тканей к кишечному барьеру через общую циркуляцию, что объясняет его повышенный уровень в плазме.

Мы наблюдали, что нормальное «метаболическое старение» (снижение уровней ЛПВП/ЛПОНП и глюкозы в плазме), происходящее в период полового созревания, ускорялось при лечении тиамулином™. Интересно, что снижение соотношения ЛПВП/ЛПОНП и уровня глюкозы в общем кровотоке было связано с повышением уровня стероидных гормонов и, в частности, прогестерона [35–37]. Цитохром P450 3A (CYP3A, важное семейство ферментов, присутствующих в печени и участвующих в детоксикации лекарств) участвует в метаболизме стероидных гормонов (прогестерона, эстрогена и тестостерона).Кроме того, в нескольких исследованиях было показано, что снижение активности CYP3A обычно приводит к повышению концентрации стероидных гормонов в плазме [38–40]. Антибиотики — это активные молекулы, которые могут напрямую взаимодействовать с хозяином, если они способны преодолевать кишечный барьер. Сообщалось, что Тиамулин™ взаимодействует с CYP3A, образуя комплекс, который приводит к инактивации цитохрома in vitro и in vivo [41–44]. Таким образом, вполне вероятно, что наблюдаемый метаболический сдвиг в период до полового созревания является результатом взаимодействия Тиамулина™ с метаболизмом прогестерона.Это также подтверждается тем фактом, что начало яйцекладки, которое сильно зависит от созревания метаболизма стероидов, произошло раньше в двух группах, получавших самые высокие дозы Тиамулина™ [15]. В целом это подтверждает потенциальное взаимодействие Тиамулина™ с метаболизмом стероидов.

Наконец, сдвиг липопротеинов также может быть вызван модификациями микробиоты кишечника вследствие лечения антибиотиками. Метаболическое взаимодействие хозяин-ГМ широко исследовано. Действительно, во многих исследованиях сообщается, что ожирение и гомеостаз энергетического метаболизма тесно связаны с составом микробиоты кишечника [24, 45–47].Кроме того, было продемонстрировано, что использование антибиотиков до полового созревания у людей и мышей может быть связано с повышенным риском метаболических нарушений из-за модулирования микробиоты кишечника [26, 48, 49]. Интересно, что низкое соотношение Firmicutes/Bacteroidetes, как сообщается, связано с худощавым фенотипом и более низким риском развития нарушений, характеризующихся модификацией метаболизма холестерина [2, 50, 51]. Однако это противоречит нашим наблюдениям, которые предполагают, что обнаруженная модификация ЛПОНП/ЛПВП может быть вызвана самим тиамулином, а не модификациями микробиоты: является ли это общим явлением для некоторых или всех классов антибиотиков, несомненно, очень заслуживает будущего. изучать.Также мы должны помнить, что другие бактериальные изменения могут быть ответственны за модификацию метаболизма холестерина: действительно известно, что некоторые молочнокислые бактерии способны метаболизировать холестерин [52], и их использование в качестве кормовой добавки у цыплят-бройлеров приводило к снижению концентрации холестерина в плазме [52]. 53]. Следовательно, потребуются дальнейшие эксперименты, чтобы разделить эти аспекты.

Заключение

Эта работа демонстрирует, что состав микробиоты кишечника может быть связан с нарушениями системного метаболизма хозяина, которые приводят к фенотипическим изменениям.Мы наблюдали, что инфекция была связана с дисбактериозом, снижением усвоения питательных веществ и нарушением энергетического обмена хозяина, что приводило к значительному снижению скорости роста. Были идентифицированы два системных биомаркера инфекции: глицерин и бетаин. Повышение системного глицерина ясно иллюстрирует метаболическую адаптацию хозяина к кишечной инфекции, направленную на обеспечение достаточного количества энергии для выживания. Однако предположительно все же наблюдалось нарушение прибавки массы тела, поскольку глицерин, вероятно, поступал из жировой ткани.Кроме того, симптомы, связанные с колонизацией патогеном, наблюдались только в том случае, если они были связаны с микробным дисбиозом кишечника. Это открытие убедительно подтверждает потенциальную защитную роль микробиоты кишечника от условно-патогенных микроорганизмов. Это указывает на необходимость проведения дальнейших исследований для понимания экологического контекста, в котором патогенная бактерия может стать вредной для своего хозяина. В этом исследовании лечение антибиотиками уменьшало инфекцию и связанные с ней симптомы при одновременном изменении метаболизма холестерина.На основании наших результатов и ранее опубликованной работы мы выдвинули гипотезу о том, что метаболический ответ хозяина на лечение антибиотиками является результатом одновременной модификации состава кишечной микробиоты и метаболизма стероидов. Эти данные свидетельствуют о том, что влияние потребления антибиотиков на энергетический метаболизм хозяина следует изучать как ответ на прямое взаимодействие и через посредничество кишечной микробиоты. Наконец, антибиотик вызвал снижение α-разнообразия с последующим дисбактериозом, который может привести к большей уязвимости к колонизации патогеном и способствовать рецидиву.Следовательно, следует рассмотреть возможность лечения антибиотиками в сочетании с пищевыми добавками, такими как пре/про/симбиотики, для восстановления «более здоровой» кишечной микробиоты после вмешательства.

Методы

Изучение животных и план эксперимента

Кратко: 150 коммерческих кур-несушек NovoGen Brown в возрасте 16–17 недель, полученных от коммерческого поставщика (Tom Barron Ltd., Великобритания), содержали в APHA (Аддлстоун, Суррей, Великобритания). в соответствии с инструкциями Министерства внутренних дел (лицензия Министерства внутренних дел -PPL 70/7249-), и все процедуры проводились в соответствии с Законом о научных процедурах в отношении животных 1986 года.После исследования животных сжигали на месте, чтобы избежать риска заражения патогеном окружающей среды.

Экспериментальный план был описан ранее Woodward et al. [15] и для наглядности сведены на рис. Животных случайным образом распределяли по пяти группам ( n  = 30), получая следующие обработки: группа A: необработанные, неинфицированные контроли; Группа B: необработанные, инфицированные контроли; Группа C: инфицированные + тиамулин™ при 62,5 млн; Группа D: инфицированные + тиамулин™ при 125 мд; Группа E: инфицированные + тиамулин™ при 250 ppm.

После нейтрализации зоба птиц заражали через желудочный зонд 1 мл суспензии B. pilosicoli B2904 (5 × 10 9  КОЕ/мл) в течение пяти дней каждые два дня [54]. Через неделю после окончания заражения группы C, D и E получали различные концентрации тиамулина™ в питьевой воде в течение пяти дней. Затем птиц наблюдали в течение трех недель. Корм представлял собой нелекарственные гранулы несушек (Додсон и Хоррелл), а воду давали из водопровода, птицы имели доступ к обоим вволю.

Сбор образцов при исследовании на животных

Биопсии, образцы плазмы и фекалий были собраны во время патологоанатомического исследования в трех временных точках: на следующий день после окончания инфекционного процесса (PM1), на следующий день после окончания антибиотикотерапии лечения (РМ2) и в конце исследования (РМ3) (рис. а). Для каждой группы и момента времени случайным образом отбирали восемь птиц и проводили эвтаназию путем седативного действия с использованием смеси ромпун/кетамин в виде внутримышечной инъекции с последующей внутривенной инъекцией пентобарбитона.Кровь брали сначала из сердца, а сыворотку замораживали при - 80 °C после образования сгустка. Образцы биопсии ткани (приблизительно 1   г для всех тканей) и образцы фекалий, собранные непосредственно из кишечного тракта енота и слепой кишки (приблизительно 1   г), были быстро заморожены в жидком азоте, а затем сохранены при температуре - 80  °C для будущей оценки их метаболический состав и профиль микробиома слепой кишки.

Данные об общем влиянии инфекции и лечения Тиамулином™ на уровень инфекции, рост, состояние здоровья птиц (оценивается путем наблюдения за оперением птицы и развитием мускулатуры), яйценоскость, потребление воды и корма также приведены в вышеупомянутом статье [15] и здесь не повторяются.

Подготовка проб для ЯМР

Экстракцию полярных метаболитов почек, поджелудочной железы, селезенки и печени проводили путем гомогенизации 0,1 г ткани в 1 мл смеси 3:1 ( v /v) метанол/H 2 O с использованием раствора тканевый лизер [55]. После центрифугирования (10 мин при 12000×g) супернатанты высушивали в скоростном вакууме и ресуспендировали в 600 мкл фосфатного буфера (0,2М), содержащего 90% D 2 O и 10% H 2 O плюс 0,01%. 3-(триметилсилил)пропионат-2,3-d4 натрия (TSP используется в качестве внутреннего стандарта).Затем образцы (0,5 мл) переносили в 5 мм ЯМР-пробирки для сбора. Образцы плазмы смешивали с фосфатно-солевым буфером с 90% D2O в соотношении 2:1 (об./об.), затем 0,5 мл переносили в 5 мм пробирки для ЯМР. 0,0150 мкг биоптата печени добавляли с фосфатным буфером в центрифуге для твердотельной ЯМР-спектроскопии.

ЯМР-спектроскопия

Для тканей 1 Спектры Н-ЯМР были получены на спектрометре Bruker Advance 700 МГц с использованием стандартной импульсной программы noesypr1D с предварительным насыщением водой (задержка релаксации 2 с и время перемешивания 100 мс).Спектры 1D ЯМР плазмы были получены с использованием импульса Карра-Перселла-Мейбум-Гилла (CPMG). Биоптаты печени были получены на спектрометре Bruker Advance с частотой 500 МГц с использованием зонда 1 H HR MAS. Спектры были получены с использованием стандартного импульса noesypr1D, а также CPMG. Для всех матриц были проведены эксперименты 2D ЯМР на выбранных образцах, чтобы помочь идентифицировать метаболиты, а также ранее опубликованный атлас метаболизма цыплят [55]. Спектры были получены с использованием 256 сканирований с 16 фиктивными сканами (DS). Все спектры были записаны как 64 тыс. точек данных (15  м.д.).

Методы выделения ДНК для популяционных исследований на основе 16S

ДНК из образцов фекалий экстрагировали с использованием набора для выделения ДНК PowerSoil® ( MO BIO Laboratories, Inc) , приобретенного Qiagen. Для обеспечения качества образцов ДНК после экстракции была проведена ПЦР универсальной области V4-V5 16S рРНК (условия циклирования: 94°С в течение 3 мин; 30° циклов: 94°С в течение 30°с, 55°С в течение 45°с, 72°C в течение 1 мин, затем 72°C в течение 8 мин) и концентрацию оценивали с помощью капли Nano.Праймеры для ПЦР были следующими:

Секвенирование 16S следующего поколения

Аликвоты выделенной ДНК амплифицировали с универсальными праймерами для областей V4 и V5 гена 16S рРНК. Праймеры U515F (5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTA) и U927R (5′-CCCGYCAATTCMTTTTRAGT) были разработаны для обеспечения амплификации как бактериальных, так и архейных участков рибосомных генов [56]. Праймеры прямого слияния состояли из праймера A GS FLX Titanium и библиотечного ключа (5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG) вместе с одним из набора из восьми 10-основных мультиплексных идентификаторов (MID) (Roche Diagnostics Ltd., СОЕДИНЕННОЕ КОРОЛЕВСТВО). Праймеры для обратного слияния включали титановый праймер B GS FLX и библиотечный ключ (5’-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG). Амплификацию проводили с помощью полимеразы FastStart HiFi (Roche Diagnostics Ltd., Великобритания) при следующих условиях циклирования: 94°С в течение 3 мин; 25 циклов: 94 °C в течение 30 с, 55 °C в течение 45 с, 72 °C в течение 1 мин; затем 72 °C в течение 8 мин. Ампликоны очищали с использованием магнитных шариков Ampure XP (Beckman Coulter) и измеряли концентрацию каждого образца с использованием анализа Picogreen на основе флуоресценции (Invitrogen).Концентрации были нормализованы перед объединением образцов в партии до 16, каждая из которых впоследствии будет идентифицирована своим уникальным MID. Затем объединенные образцы подвергали однонаправленному секвенированию, начиная с прямого праймера, на платформе 454 GS FLX Titanium в соответствии с инструкциями производителя (Roche Diagnostics).

Конвейер Ampliconnoise [57] был использован для разделения набора данных на отдельные файлы для каждого образца в соответствии с используемыми адаптерами MID, а затем для удаления ошибок пиросеквенирования, ошибок ПЦР и химерных последовательностей.Для дальнейшего анализа оставляли только последовательности длиной более 400 оснований. Затем обработанные последовательности были классифицированы с использованием процесса выбора открытых эталонных OTU, реализованного в QIIME v1.9.1 (Caporaso, et al. 2010), по базе данных генов 16S рРНК Greengenes (http://greengenes.secondgenome.com/downloads/). Полученное распределение OTU по нескольким образцам было дополнительно проанализировано с использованием QIIME v1.9.1. обобщить распределения и исследовать альфа- и бета-разнообразие [58].

Статистический анализ

Для метабономического анализа после применения экспоненциального окна с расширением линии 0.3 Гц и преобразование Фурье, спектры индивидуально фазировали и корректировали по базовой линии в программе MestReNova (Mestrelab Research v.8.1.2). Затем спектры были импортированы в Matlab (Mathwork® v2013a), где они были откалиброваны по TSP (δ 0,00) для всех тканевых экстрактов, лактату (δ 1,33) для плазмы и протону H 1 α-глюкозы (δ 5,23) для биопсия печени. Спектры нормировались для каждой матрицы индивидуально с помощью метода вероятностных отношений [59]. Метаболические различия между образцами оценивали с помощью анализа основных компонентов (PCA).Этот шаг также использовался для удаления потенциальных выбросов, которые считались таковыми, если при регистрации не удалось получить спектр, сравнимый с другими образцами того же набора. Когда были выявлены интересующие групповые кластеры, ортогональная проекция на дискриминантный анализ латентной структуры (O-PLS DA) использовалась для оценки метаболических вариаций между группами с использованием спектров ЯМР в качестве матрицы независимых переменных и инфекции или лечения в качестве вектора прогнозирования. Алгоритм регрессионных моделей предоставлен компанией Korrigan Sciences Ltd.

Критерий Уилкоксона использовали для оценки значимости вариаций между группами в отношении массы тела и α-разнообразия с использованием R. Также был проведен тест MANOVA для определения влияния времени, инфекции и лечения на α-разнообразие на R (модель < − aov(α-разнообразие ~ время*инфекция*лечение). Наконец, из-за глубины секвенирования и метода мы решили провести анализ микробного сообщества на уровне семейства, а не на более низком таксономическом уровне. Статистический анализ проводился на нулевом завышенном логарифме преобразованное относительное изобилие.Всего было обнаружено 54 семейства, но только 40 присутствовали как минимум в 25% образцов. Бета-разнообразие на уровне семьи было выполнено путем расчета евклидова расстояния между особями.

Дополнительные файлы

Дополнительный файл 1: (14M, eps)

Инфекция изменяет метаболическую активность ГМ и содержание полисахаридов в просвете кишечника. (A) Баллы OPLS-DA по сравнению с перекрестно подтвержденными баллами, рассчитанными с использованием спектров фекальной воды групп A и B в PM2 и инфекции в качестве предиктора.(B) График загрузки, связанный с моделью OPLS-DA, описанной в A. (EPS 14763 kb)

Дополнительный файл 2: (615K, eps)

Уровень бетаина в плазме при PM2 для всех групп, A: контроль, B: Зараженные, C: инфицированные и пролеченные (62 ppm), D: инфицированные и пролеченные (125 ppm), E: инфицированные и пролеченные (250 ppm). * pv < 0,05; ** pv < 0,01. (EPS 614 kb)

Дополнительный файл 3: (601K, eps)

Уровень глюкозы в плазме при PM2 для всех групп, A: контроль, B: инфицированные, C: инфицированные и пролеченные (62 ppm), D: инфицированные и пролеченные (125 ppm), E: инфицированные и пролеченные (250 ppm).* pv < 0,05; ** pv < 0,01. (EPS 601 kb)

Дополнительный файл 4: (14M, eps)

Линейный ответ плазмы на лечебную дозу тиамулина. (A) График оценок в сравнении с перекрестно подтвержденными оценками регрессионной модели O-PLS, рассчитанными с использованием спектров H-ЯМР 1 птиц в PM2 в качестве матрицы независимых переменных и доз тиамулина в качестве предиктора. Параметры модели: R 2 Y = 0,48, Q 2 Y = 0,43 и p -значение = 0,01 (EPS 13970 кб)

Дополнительный файл 5 в процентах: (948K, eps05 относительное содержание) 900 OTU спирохет для каждой лечебной группы в ходе исследования.(EPS 948 kb)

Дополнительный файл 6: (2.0M, eps)

Нагрузки, связанные с графиком оценок PCA на рис., рассчитаны с использованием относительного количества OTU для всех образцов в качестве матрицы независимой переменной. А, нагрузки ПК1. B, Загрузка ПК2. (EPS 2121 КБ)

Дополнительный файл 8: (2.0K, csv)

Таблица S8 . Пример ключа и метаданных для дополнительного файла 7: таблица S7. (CSV 2 kb)

Благодарности

Авторы выражают благодарность Novartis за финансирование испытаний на животных.Мы также хотим поблагодарить сотрудников APHA и доктора Люка Дж. Мэппли за помощь в исследованиях in vivo, а также доктора Радослава Михала Ковальчика из Химико-аналитического центра (CAF) Университета Рединга за его помощь во время получения спектров 2D ЯМР. .

Финансирование

Мы признательны за поддержку компании Novartis, которая спонсировала исследование на животных, о котором сообщалось ранее [15], в рамках которого с разрешения были проведены эти дополнительные исследования.

Доступность данных и материалов

Данные о микробиоме, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью в Дополнительный файл 7: Таблица S7 [и Дополнительный файл 8 с образцом ключа для инфекции и лечения].Необработанные последовательности общедоступны в общедоступном хранилище EBI под регистрационным номером: PRJEB29134. Наборы метаболомных данных (спектры ЯМР), использованные и/или проанализированные в ходе текущего исследования, можно получить у соответствующего автора по обоснованному запросу.

Сокращения

ЛПВП липопротеинов высокой плотности
ЯМР Ядерный магнитный резонанс
О-PLS Д.А. Ортогональные проекции на латентные структуры дискриминантного анализа
РСА основного компонента Анализ
PM Post Mortl
VLDL
VLDL Очень низкая плотность Липопротеин

Взносы авторов

Исследование было разработано MJW, RMLR и SPC и образцами, собранными CLR.Получение ЯМР, статистика и анализ данных были проведены CLR, секвенирование следующего поколения и аннотация были выполнены RJE. Рукопись была составлена ​​CLR и проверена SPC, MJW, RMLR и RJE. Все авторы прочитали и одобрили рукопись.

Примечания

Утверждение этических норм и согласие на участие

Все процедуры проводились в соответствии с пересмотренным Законом о научных процедурах в отношении животных от 1986 г. в Великобритании и Директивой 2010/63ЕС в Европе, одобренной Агентством по охране здоровья животных и растений (APHA- https //www.gov.uk/government/organisations/animal-and-plant-health-agency/about/research#ethics-committee), а птиц содержали в соответствии с рекомендациями Министерства внутренних дел (лицензия Министерства внутренних дел -PPL 70/7249-). В этом исследовании использовались коммерческие куры-несушки NovoGen Brown, полученные от коммерческого поставщика (Tom Barron Ltd., Великобритания). Все эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями контрольного списка ПРИБЫТИЯ (Дополнительный файл 9).

Согласие на публикацию

Не применимо.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов в отношении этой работы.

Примечание издателя

Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

Ссылки

1. Хупер Л.В., Литтман Д.Р., Макферсон А.Дж. Взаимодействие микробиоты и иммунной системы. Наука. 2012;336(6086):1268–1273. doi: 10.1126/science.1223490. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]2. Лей Р.Е., Тернбо П.Дж., Кляйн С., Гордон Дж.И. Микробная экология: кишечные микробы человека, связанные с ожирением.Природа. 2006; 444:1022. doi: 10.1038/4441022a. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]3. Кани П.Д., Делзенн Н.М. Роль микробиоты кишечника в энергетическом обмене и метаболических заболеваниях. Курр Фарм Дез. 2009; 15:1546–1558. doi: 10.2174/138161209788168164. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]4. Клаус С.П., Эллеро С.Л., Бергер Б., Краузе Л., Бруттин А. и др. Индуцированное колонизацией микробное метаболическое взаимодействие между хозяином и кишечником. МБио. 2011;2:e00271–e00210. doi: 10.1128/mBio.00271-10. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]5.Спор А., Корен О., Лей Р. Раскрытие влияния окружающей среды и генотипа хозяина на микробиом кишечника. Nat Rev Microbiol. 2011;9:279. doi: 10.1038/nrmicro2540. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]6. Антарам В.К., Ли Э., Измаил А., Шарма А., Май В., Рэнд К.Х. и др. Дисбактериоз кишечника и истощение маслянообразующих бактерий при инфекции Clostridium difficile и нозокомиальной диарее. JCM. 2013;51(9):2884–2892. doi: 10.1128/JCM.00845-13. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]7.Schulfer AF, Battaglia T, Alvarez Y, Bijnens L, Ruiz VE, et al. Межпоколенческая передача нарушенной антибиотиками микробиоты усиливает колит у восприимчивых мышей. Нат микробиол. 2018;3:234. doi: 10.1038/s41564-017-0075-5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]8. Le Roy CI, Mappley LJ, La Ragione RM, Woodward MJ, Claus SP. Индуцированный Brachyspira pilosicoli кишечный спирохетоз птиц. Microb Ecol Health Дис. 2015;26:28853. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]9. Мэппли Л.Дж., Ла Раджоне Р.М., Вудворд М.Дж. Brachyspira и ее роль в кишечном спирохетозе птиц. Вет микробиол. 2014; 168: 245–260. doi: 10.1016/j.vetmic.2013.11.019. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 10. Дварс Р.М., Давелаар Ф.Г., Смит Х.Ф. Заражение родительских кур-бройлеров кишечными спирохетами птиц: влияние на яйценоскость и качество цыплят. Авиан Патол. 1993; 22: 693–701. doi: 10.1080/03079459308418957. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11. Поульсен С.М., Карлссон М., Йоханссон Л.Б., Вестер Б. Препараты плевромутилина тиамулин и валнемулин связываются с РНК в пептидилтрансферазном центре на рибосоме.Мол микробиол. 2001;41:1091–1099. doi: 10.1046/j.1365-2958.2001.02595.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 12. Pringle M, Landén A, Unnerstad HE, Molander B, Bengtsson B. Чувствительность к противомикробным препаратам свиней Brachyspira hyodysenteriae и Brachyspira pilosicoli , выделенных в Швеции в период с 1990 по 2010 год. Acta Vet Scand. 2012;54:54. дои: 10.1186/1751-0147-54-54. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]13. Стивенс CP, Хэмпсон DJ. Оценка тиамулина и линкомицина для лечения племенных бройлеров, экспериментально инфицированных кишечной спирохетой Brachyspira pilosicoli .Авиан Патол. 2002; 31: 299–304. doi: 10.1080/03079450220136501. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Burch DGS, Harding C, Alvarez R, Valks M. Лечение полевого случая кишечного спирохетоза птиц, вызванного Brachyspira pilosicoli , тиамулином. Авиан Патол. 2006; 35: 211–216. doi: 10.1080/03079450600711011. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Вудворд М.Дж., Мэппли Л., Ле Рой С., Клаус С.П., Дэвис П. и др. Применение Denagard® Tiamulin в питьевой воде для борьбы с инфекцией Brachyspira pilosicoli птицы-несушки.рез. вет. 2015;103:87–95. doi: 10.1016/j.rvsc.2015.09.015. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Le Roy CI, Passey JL, Woodward MJ, La Ragione RM, Claus SP. Метабономический анализ реакции Brachyspira pilosicoli на тиамулин показывает метаболическую активность, несмотря на значительное торможение роста. Анаэроб. 2017;45:71–77. doi: 10.1016/j.anaerobe.2017.03.018. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Lozupone CA, Stombaugh JI, Gordon JI, Jansson JK, Knight R. Разнообразие, стабильность и устойчивость микробиоты кишечника человека.Природа. 2012;489:220. doi: 10.1038/nature11550. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]18. Родригес Р.Р., Грир Р.Л., Донг Х, Д.Суза К.Н., Гурунг М. и др. Вызванные антибиотиками изменения микробиоты кишечника связаны с изменениями метаболизма глюкозы у здоровых мышей. Фронт микробиол. 2017;8:2306. doi: 10.3389/fmicb.2017.02306. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]19. Li J, Yang K, Ju T, Ho T, McKay CA, et al. Воздействие антибиотиков в раннем возрасте влияет на развитие островков поджелудочной железы и регуляцию метаболизма.Научный доклад 2017; 7: 41778. doi: 10.1038/srep41778. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]20. Детлефсен Л., Релман Д.А. Неполное восстановление и индивидуальная реакция микробиоты дистального отдела кишечника человека на повторное воздействие антибиотиков. ПНАС. 2001; 108 (Приложение 1): 4554–4561. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]21. Агилера М., Серда-Куэльяр М., Мартинес В. Дисбиоз, вызванный антибиотиками, изменяет взаимодействие хозяина и бактерий и приводит к сенсорным и моторным изменениям толстой кишки у мышей. Кишечные микробы.2015; 6:10–23. doi: 10.4161/194.2014.9

. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]22. Стечер Б., Майер Л., Хардт В.Д. «Цветение» в кишечнике: как дисбиоз может способствовать эволюции патогенов. Nat Rev Microbiol. 2013;11:277. doi: 10.1038/nrmicro2989. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Субраманиан С., Хук С., Яцуненко Т., Хак Р., Махфуз М. и др. Стойкая незрелость микробиоты кишечника у детей Бангладеш, страдающих от недоедания. Природа. 2014;510:417. doi: 10.1038/nature13421. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]24.Клаус СП. Борьба с недоеданием: не забывайте об ошибках. Клеточный микроб-хозяин. 2016;13:239–240. doi: 10.1016/j.chom.2013.02.015. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Тремароли В., Бекхед Ф. Функциональные взаимодействия между микробиотой кишечника и метаболизмом хозяина. Природа. 2012; 489:242. doi: 10.1038/nature11552. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 26. Кокс Л.М., Яманиши С., Сон Дж., Алексеенко А.В., Леунг Дж.М. и соавт. Изменение кишечной микробиоты во время критического окна развития имеет длительные метаболические последствия.Клетка. 2014; 158:705–721. doi: 10.1016/j.cell.2014.05.052. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]27. Мэппли Л.Дж., Чоржевска М.А., Кули В.А., Вудворд М.Дж., Ла Раджоне Р.М. Лактобациллы препятствуют росту, подвижности и прикреплению Brachyspira pilosicoli : потенциальное вмешательство против птичьего кишечного спирохетоза. АЕМ. 2011;77(15):5402–5411. doi: 10.1128/AEM.00185-11. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]28. Нареш Р., Хэмпсон DJ. Аттракцион Brachyspira pilosicoli к муцину.Микробиология. 2010; 156:191–197. doi: 10.1099/микрофон 0.030262-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Мэппли Л.Дж., Блэк М.Л., Абуун М., Дарби А.С., Вудворд М.Дж. и др. Сравнительная геномика штаммов Brachyspira pilosicoli : геномные перестройки, редукция и корреляция генетического комплемента с фенотипическим разнообразием. Геномика BMC. 2012;13:454. дои: 10.1186/1471-2164-13-454. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]31. Mappley LJ, Tchórzewska MA, Nunez A, Woodward MJ, Bramley PM, et al.Пероральное лечение цыплят Lactobacillus reuteri LM1 снижает патологию, индуцированную Brachyspira pilosicoli . ДжММ. 2013; 62: 287–296. [PubMed] [Google Scholar] 32. Хосрави Ю., Бунте Р.М., Чиоу К.Х., Тан Т.Л., Вонг В.Ю. и др. Helicobacter pylori и микробиота кишечника модулируют энергетический гомеостаз, прежде чем вызвать гистопатологические изменения у мышей. Кишечные микробы. 2016;7:48–53. doi: 10.1080/194.2015.1119990. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]33.Фелицкий Д.Дж., Кэннон Дж.Г., Капп М.В., Хонг Дж., Ван Винсберг А.В. и др. Исключение бетаина глицина с поверхности анионного биополимера: почему бетаин глицина является эффективным осмопротектором, но также и совместимым растворенным веществом. Биохимия. 2004;43:14732–14743. дои: 10.1021/bi049115w. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 34. Крейг С.А. Бетаин в питании человека. Am J Clin Nutr. 2004; 80: 539–549. doi: 10.1093/ajcn/80.3.539. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 35. Кушваха Р.С., Льюис Д.С., Кэри К.Д., JrHC MG. Влияние эстрогена и прогестерона на липопротеины плазмы и экспериментальный атеросклероз у павианов ( Papio sp. ) Тромб атеросклероза. 1991; 11: 23–31. doi: 10.1161/01.ATV.11.1.23. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 36. Судья С.М., Чаттертон РТ. Прогестерон-специфическая стимуляция биосинтеза триглицеридов в клеточной линии рака молочной железы (T-47D) Cancer Res. 1983; 43:4407–4412. [PubMed] [Google Scholar] 37. Сакс FM, Уолш Б.В. Влияние половых гормонов на липопротеины сыворотки крови: нерешенные вопросы биологии и клинической практики. Энн Н.Ю. Академия наук. 1990; 592: 272–285. doi: 10.1111/j.1749-6632.1990.tb30339.Икс. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 38. Нацухори М., ван Раак М., Лигтенберг М., Клей Л., тен Берге Д. и др. Выделение последовательности кДНК полноразмерного цитохрома P450 (CYP3A) крупного рогатого скота и ее функциональная экспрессия в клетках V79. Environ Toxicol Pharmacol. 1997; 3:17–24. doi: 10.1016/S1382-6689(96)00133-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 39. Бертилссон Г., Хайдрих Дж., Свенссон К., Осман М., Джендеберг Л. и др. Идентификация ядерного рецептора человека определяет новый сигнальный путь для индукции CYP3A.ПНАС. 1998;95:12208–12213. doi: 10.1073/pnas.95.21.12208. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]40. Лемли К.О., Батлер С.Т., Батлер В.Р., Уилсон М.Э. Инсулин изменяет катаболические ферменты прогестерона в печени цитохрома Р450 2С и 3А у молочных коров. JDS. 2008; 91: 641–645. [PubMed] [Google Scholar]41. Виткамп Р.Ф., Неймейер С.М., Ван Мирт А.С. Образование комплекса цитохрома Р-450 в печени крыс под действием антибиотика тиамулина. Противомикробные агенты Chemother. 1996;40:50–54. doi: 10.1128/AAC.40.1.50. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]42.Де Гроен Э.М., Неймейер С.М., Хорбах Г.Дж., Виткамп Р.Ф. Тиамулин ингибирует активность CYP3A4 человека в клеточной линии NIH/3T3, стабильно экспрессирующей кДНК CYP3A4. Биохим Фармакол. 1995; 50: 771–773. doi: 10.1016/0006-2952(95)00197-8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]43. Zweers-Zeilmaker WM, Van Miert AS, Horbach GJ, Witkamp RF. Комплексообразование in vitro и ингибирование активности цитохрома Р450 печени различными макролидами и тиамулином у коз и крупного рогатого скота. рез. вет. 1999; 66: 51–55. doi: 10.1053/rvsc.1998.0239. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]44. Ratz V, Laczay P, Mora ZS, Csiko GY, Monostori K, et al. Недавние исследования влияния тиамулина и монензина на активность цитохрома Р450 в печени у кур и индеек. J Vet Pharmacol Ther. 1997; 20: 415–418. doi: 10.1046/j.1365-2885.1997.00092.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]45. Муссо Г., Гамбино Р., Кассадер М. Взаимодействия между микробиотой кишечника и метаболизмом хозяина, предрасполагающие к ожирению и диабету. Анну Рев Мед. 2011;62:361–380. дои: 10.1146/аннурев-мед-012510-175505. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]46. Эверард А., полицейский Кани. Сахарный диабет, ожирение и микробиота кишечника. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2013; 27:73–83. doi: 10.1016/j.bpg.2013.03.007. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]47. Ларсен Н., Вогенсен Ф.К., ван ден Берг Ф.В., Нильсен Д.С., Андреасен А.С. и соавт. Микробиота кишечника у взрослых людей с диабетом 2 типа отличается от таковой у взрослых без диабета. ПЛОС Один. 2010;5:e9085. doi: 10.1371/journal.pone.0009085. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]48.Чо И., Яманиши С., Кокс Л., Мете Б.А., Завадил Дж. и др. Антибиотики в раннем возрасте изменяют микробиом толстой кишки мышей и ожирение. Природа. 2012; 488:621. doi: 10.1038/nature11400. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]49. Trasande L, Blustein J, Liu M, Corwin E, Cox LM, et al. Воздействие антибиотиков на младенцев и масса тела в раннем возрасте. Инт Дж. Обес. 2013;37:16. doi: 10.1038/ijo.2012.132. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]50. Ley RE, Bäckhed F, Turnbaugh P, Lozupone CA, Knight RD, et al.Ожирение изменяет микробную экологию кишечника. ПНАС. 2005; 102:11070–11075. doi: 10.1073/pnas.0504978102. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]51. Тернбо П.Дж., Лей Р.Е., Маховальд М.А., Магрини В., Мардис Э.Р. и др. Связанный с ожирением кишечный микробиом с повышенной способностью собирать энергию. Природа. 2006; 444:1027. doi: 10.1038/nature05414. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]52. Перейра Д.И., Гибсон Г.Р. Ассимиляция холестерина молочнокислыми бактериями и бифидобактериями, выделенными из кишечника человека.Appl Environ Microbiol. 2002; 68: 4689–4693. doi: 10.1128/AEM.68.9.4689-4693.2002. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]53. Джин Л.З., Хо Ю.В., Абдулла Н., Джалалудин С. Показатели роста, кишечные микробные популяции и уровень холестерина в сыворотке бройлеров, получавших рацион, содержащий культур Lactobacillus . Poult Sci. 1998; 77: 1259–1265. doi: 10.1093/ps/77.9.1259. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]54. Мэппли Л.Дж., Чоржевска М.А., Нуньес А., Вудворд М.Дж., Ла Рагионе Р.М. Доказательства системного распространения потенциально зоонозной кишечной спирохеты Brachyspira pilosicoli у экспериментально зараженных кур-несушек.J Med Microbiol. 2013; 62: 297–302. doi: 10.1099/jmm.0.052126-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]55. Le Roy CI, Mappley LJ, La Ragione RM, Woodward MJ, Claus SP. Метаболическая характеристика куриных тканей и биожидкостей на основе ЯМР: модель для исследования птиц. Метаболомика. 2016;12:157. doi: 10.1007/s11306-016-1105-7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]56. Эллис Р.Дж., Брюс К.Д., Дженкинс С., Стотард Дж.Р., Аджарова Л. и др. Сравнение микробиоты дистального отдела кишечника людей и животных в Африке.ПЛОС Один. 2013;8:e54783. doi: 10.1371/journal.pone.0054783. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]58. Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, Bittinger K, Bushman FD, et al. QIIME позволяет анализировать данные секвенирования с высокой пропускной способностью. Нат Методы. 2010;7:335. doi: 10.1038/nmeth.f.303. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]59. Гаваган С.Л., Уилсон И.Д., Николсон Дж.К. Физиологическая вариация в метаболическом фенотипировании и функциональных геномных исследованиях: использование коррекции ортогонального сигнала и PLS-DA.ФЭБС лат. 2002; 530:191–196. doi: 10.1016/S0014-5793(02)03476-2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Лечение антибиотиками вызывает дисбактериоз кишечника и модулирует метаболизм в куриной модели желудочно-кишечной инфекции

BMC Vet Res. 2019; 15: 37.

,

, 1, 2 ,
2 , 1 , 3 , , 3 , 4 1

0 1

Caroline Ivanne Le Roy

1 Департамент пищевых и пищевых наук, University of Reading, Whiteknights, Reading, RG6 6AP UK

2 Текущий адрес: Департамент исследований близнецов и генетической эпидемиологии, King’s College London, London, SE1 7EH UK

Martin John Woodward

1 Департамент пищевых продуктов и Науки о питании, Университет Рединга, Уайтнайтс, Рединг, RG6 6AP UK

Richard John Ellis

3 Центральный отдел секвенирования, Агентство по охране здоровья животных и растений, Addlestone, Surrey, KT15 3NB UK

Roberto Marcello La Ragione

2 4 Факультет здоровья и медицинских наук, Школа ветеринарной медицины, Университет Суррея, Гилфорд, Суррей, GU2 7AL UK

Sandrine Paule Claus

1 Факультет наук о пищевых продуктах и ​​питании, Университет Рединга, Уайтнайтс, Рединг, RG6 6AP UK

1 Департамент наук о пищевых продуктах и ​​питании, Университет Рединга, Уайтнайтс, Рединг, RG6 6AP UK

2 Настоящее время Адрес: Департамент исследований близнецов и генетической эпидемиологии, Королевский колледж Лондона, Лондон, SE1 7EH UK

3 Центральный отдел секвенирования, Агентство здоровья животных и растений, Addlestone, Surrey, KT15 3NB UK

4 Факультет здравоохранения и Медицинские науки, Школа ветеринарной медицины, Университет Суррея, Гилфорд, Суррей, GU2 7AL UK

Автор, ответственный за переписку.

Поступила в редакцию 14 сентября 2018 г.; Принято 21 декабря 2018 г.

Открытый доступ Эта статья распространяется в соответствии с условиями международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что вы укажете автора(ов) оригинала и источник, предоставите ссылку на лицензию Creative Commons и укажете, были ли внесены изменения. Отказ от права Creative Commons на общественное достояние (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) относится к данным, доступным в этой статье, если не указано иное. Эта статья цитировалась в других статьях в PMC.
Дополнительные материалы

Дополнительный файл 1: Инфекция изменяет метаболическую активность ГМ и содержание полисахаридов в просвете кишечника. (A) Баллы OPLS-DA по сравнению с перекрестно подтвержденными баллами, рассчитанными с использованием спектров фекальной воды групп A и B в PM2 и инфекции в качестве предиктора. (B) График загрузки, связанный с моделью OPLS-DA, описанной в A.(EPS 14763 kb)

GUID: 637A03F0-C80E-4205-91CF-62195461F463

Дополнительный файл 2: Уровень бетаина в плазме при PM2 для всех групп, A: контрольная, B: инфицированные, C: инфицированные и получавшие лечение ( 62 ppm), D: инфицированные и пролеченные (125 ppm), E: инфицированные и пролеченные (250 ppm). * pv < 0,05; ** pv < 0,01. (EPS 614 КБ)

GUID: 4147F990-2E35-44CF-9D0F-E210F590E478

Дополнительный файл 3: Уровень глюкозы в плазме при PM2 для всех групп, A: контроль, B: инфицированные, C: инфицированные и получавшие лечение (62 D: инфицированные и пролеченные (125 ppm), E: инфицированные и пролеченные (250 ppm).* pv < 0,05; ** pv < 0,01. (EPS 601 kb)

GUID: A8EC82A4-CC5F-4CA2-B276-BB70050B5A57

Дополнительный файл 4: Линейный ответ плазмы на лечебную дозу тиамулина. (A) График оценок в сравнении с перекрестно подтвержденными оценками регрессионной модели O-PLS, рассчитанными с использованием спектров H-ЯМР 1 птиц в PM2 в качестве матрицы независимых переменных и доз тиамулина в качестве предиктора. Параметры модели: R 2 Y = 0,48, Q 2 Y = 0,43 и p -значение = 0.01 (EPS 13970 kb)

GUID: 6ABCB568-5DB8-4C8B-A3E5-E06A18F2EDEA

Дополнительный файл 5: Относительная численность OTU спирохет в процентах для каждой лечебной группы в ходе исследования. (EPS 948 КБ)

GUID: 6204AE20-8C5E-4D76-B50E-F36A367FD54A

Дополнительный файл 6: Переменная. А, нагрузки ПК1. B, Загрузка ПК2.(EPS 2121 КБ)

GUID: 5CE26145-34C9-428F-A47D-5808CAFBF10B

Дополнительный файл 7: Таблица S7 . Таблица количества необработанных чтений OTU. (CSV 3322 КБ)

GUID: 58B61D3D-DD60-4F43-A35F-D47A593AF3EA

Дополнительный файл 8: Таблица S8 . Пример ключа и метаданных для дополнительного файла 7: таблица S7. (CSV, 2 КБ)

GUID: E93301B8-46A1-4F6B-BBDA-2B41D7B09EC1

Дополнительный файл 9: Дополнительный материал S9. чек-лист ПРИБЫТИЯ. (PDF, 1067 КБ)

GUID: 8BC7A496-0DC5-45E7-B489-E0D0C6C1AC58

Заявление о доступности данных

S7 [и Дополнительный файл 8 с образцом ключа для заражения и лечения].Необработанные последовательности общедоступны в общедоступном хранилище EBI под регистрационным номером: PRJEB29134. Наборы метаболомных данных (спектры ЯМР), использованные и/или проанализированные в ходе текущего исследования, можно получить у соответствующего автора по обоснованному запросу.

Abstract

История вопроса

Заражение пищеварительного тракта желудочно-кишечными патогенами приводит к развитию симптомов от легкой диареи до более тяжелых клинических признаков, таких как дизентерия, сильное обезвоживание и, возможно, смерть.Хотя антибиотики эффективны для борьбы с инфекциями, они также вызывают дисбактериоз, который, как предполагается, приводит к изменению прибавки в весе в системах животноводства.

Результаты

Это первое исследование, демонстрирующее метаболическое влияние инфекции желудочно-кишечного тракта ( Brachyspira pilosicoli ) и его устранение с помощью лечения антибиотиками (тиамулин) на системный метаболизм хозяина (курицы) и состав кишечной микробиоты с использованием спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения 1 H и секвенирование нового поколения 16S рДНК (NGS).Были идентифицированы четкие системные метаболические маркеры инфекций, такие как глицерин и бетаин. Потеря веса у нелеченых животных частично объяснялась наблюдением модификации системного энергетического метаболизма хозяина, характеризующейся использованием глицерина в качестве предшественника глюкозы. Тем не менее, лечение антибиотиками вызвало повышение соотношения ЛПОНП/ЛПВП в плазме, что может способствовать уменьшению потери веса, наблюдаемой у обработанных птиц. Все метаболические реакции сопровождались значительным сдвигом микробиоты при инфекции или лечении антибиотиками.

Заключение

Это исследование показывает, что инфекция и лечение антибиотиками вызывают дисбактериоз, который может повлиять на системный энергетический метаболизм хозяина и вызвать изменения фенотипа и состояния здоровья.

Электронный дополнительный материал

Электронная версия этой статьи (10.1186/s12917-018-1761-0) содержит дополнительные материалы, доступные авторизованным пользователям.

Ключевые слова: Микробиота, метаболизм, антибиотик, энергия, дисбиоз

Предыстория

Известно, что состав кишечной микробиоты (ГМ) оказывает сильное влияние на здоровье хозяина посредством широкого спектра механизмов, начиная от контроля иммунных функций [1], метаболических гомеостаз [2, 3] и метаболизм лекарственных средств [4].Даже если в целом стабильный внутри вида состав GM сильно зависит от воздействия окружающей среды (питание, ксенобиотики и инфекции), и любая модификация этой экосистемы может повлиять на здоровье хозяина, изменяя симбиотические отношения, существующие между хозяином и его кишечными микробами [5]. . Например, присутствие условно-патогенного микроорганизма в пищеварительном тракте может протекать бессимптомно, но также вызывать серьезные нарушения здоровья. Кроме того, инфекция, как правило, связана с бактериальным дисбиозом в пищеварительном тракте [6], но влияние такой модификации на метаболизм хозяина и развитие таких симптомов, как потеря веса, до сих пор плохо изучено.Улучшение симптомов обычно наблюдается после лечения антибиотиками за счет уменьшения количества патогенных бактерий и уменьшения последствий их инфекции. Однако использование антибиотиков также связано с уменьшением разнообразия GM, что связано с дальнейшим ослаблением метаболизма хозяина [7].

Кишечный спирохетоз птиц (ККИ) вызывается колонизацией нижних отделов пищеварительного тракта птиц возбудителем Brachyspira pilosicoli (тип Spirochaetes; класс Spirochaetes; отряд Spirochaetales; семейство Bracyspiraceae) [8, 9].Бактерия прикрепляется к клеточной стенке и может вызвать диарею, связанную со снижением скорости роста и производства яиц [10]. Наиболее распространенным средством, используемым для борьбы с инфекцией, является тиамулин™, антибиотик семейства плевромутилина, который ингибирует синтез белка путем связывания с 50S-областью рибосомы [11, 12]. Лишь несколько исследований оценили его эффективность у цыплят, несмотря на его интенсивное использование для лечения птичьих стад в промышленности [13, 14]. На сегодняшний день это заболевание и его лечение мало изучены и остаются малоизученными.Действительно, причина таких симптомов, как потеря веса и снижение яйценоскости, до сих пор неясна. В недавнем исследовании [15] была оценена эффективность трех доз Тиамулина™ для лечения кур-несушек, перорально зараженных B. pilosicoli B2904, и было установлено, что инфекция была связана со снижением скорости роста и что птицы, получавшие Тиамулин™, выздоравливали от инфекции независимо от использованной дозы, в то время как поддержание массы тела наблюдалось только в ответ на две самые высокие дозы. Кроме того, Тиамулин™ значительно уменьшал другие симптомы, связанные с инфекцией, а также системное распространение B.пилосиколи . Тем не менее, через три недели после прекращения лечения антибиотиками все еще наблюдалась колонизация пищеварительного тракта возбудителем. Таким образом, мы пришли к выводу, что это исследование представляет собой интересную модель инфекции для понимания реакции системного метаболизма и микробиоты кишечника хозяина на колонизацию пищеварительного тракта патогеном. Кроме того, план эксперимента позволяет проводить продольное исследование влияния лечения антибиотиками на суперорганизм (то есть на хозяина и микробиоту его кишечника).В этой статье мы представляем результаты, полученные после анализа образцов биопсии и биожидкости, собранных в ходе предыдущего исследования [15]. Для оценки системного метаболического ответа хозяина на инфекцию и лечение антибиотиками мы использовали метаболомику на основе 1 Н-ЯМР, которая позволяет нецелевую оценку метаболических колебаний, происходящих в биологических системах. Поскольку микробиота кишечника неразрывно связана с метаболическими реакциями хозяина, ее состав в ответ на инфекцию и лечение контролировали с помощью секвенирования гена 16S рРНК (16S NGS).Оба анализа позволили по-новому взглянуть на влияние инфекции и лечения антибиотиками на здоровье хозяина, объяснив физиологическую реакцию как на бактериальное, так и на химическое воздействие.

Результаты

Инфекция и лечение антибиотиками влияют на рост и яйценоскость

Влияние инфекции и яйценоскости отслеживали на протяжении всего исследования во всех группах (A, контрольная; B только инфицированные; CE, инфицированные и получавшие Тиамулин™ от самой низкой до максимальная доза). Заражение B.pilosicoli приводил к значительному снижению скорости роста (рис. б), но к концу исследования цыплята из группы Б (зараженные) весили меньше, чем птицы из группы А (контроль), но этот результат не был значимым. Две самые высокие дозы Тиамулина™ (группа D и E) были способны поддерживать рост цыплят, поскольку к концу исследования птицы из этих двух групп имели более высокий вес, чем в контрольной группе, и этот показатель был значительно выше, чем в инфицированной группе ( p -значение < 0.05). Однако у животных, получавших самую низкую дозу (группа C), средний вес в конце исследования был аналогичен весу инфицированной группы (B) и значительно отличался от трех других (A, D и E). . Это предполагает, что только более высокие дозы антибиотиков связаны с поддержанием скорости роста во время инфекции.

Экспериментальный план ( a ) и масса тела птицы ( b )

Инфекция вызывает системный метаболический ответ хозяина

Системный метаболический ответ на инфекцию B.pilosicoli наблюдали сразу после окончания периода заражения (день 6). O-PLS-DA показал, что инфекция была связана с модификацией метаболомов почек, печени, селезенки и плазмы (рис. a, b, c и d). Печень инфицированных птиц была богаче глицерином, лактатом, холином, сукцинатом и ацетатом (рис. а). В селезенке инфекция привела к снижению O -фосфохолина, глутамина и АМФ и повышению уровня глицерина, урацила, цитидина и лейцина (рис. б). В почках инфекция вызывала увеличение содержания глицерина, урацила и ксантина при одновременном снижении содержания инозина (рис.в). Повышенное содержание бетаина и глицерина также было связано с инфекцией в плазме (рис. d). После заражения (PM1) содержимое толстой кишки инфицированных птиц было богаче полисахаридами и аминокислотами (дополнительный файл 1). Через две недели после окончания периода заражения (PM2) почки, печень и селезенка инфицированных, но не леченых птиц восстановили свой метаболический гомеостаз (больше не было обнаруживаемых метаболических различий между контрольной и любой другой группой), что указывает на отсутствие метаболические изменения наблюдались в ответ на инфекцию.Однако уровень глюкозы в плазме зараженных птиц снизился (рис. д) примерно на 50%.

Инфекция B. pilosicoli связана с основными изменениями системного метаболизма. a Графики баллов (правая панель) и нагрузки (левая панель) модели O-PLS-DA, рассчитанные с использованием спектров 1D-ЯМР печени птиц при PM1 в качестве матрицы независимых переменных и инфекции в качестве предиктора инфицированных птиц (красный квадрат) и неинфицированные птицы (синий кружок). Форма графиков нагрузки представляет собой среднее стандартное отклонение всех спектров ЯМР, полученных для данной модели, и умноженное на вес модели O-PLS DA, что позволяет визуализировать, связаны ли метаболиты с инфекцией положительно (указывая вниз) или отрицательно (указывая вверх).Цветовая шкала представляет уровень корреляции между каждой точкой данных и заражением. b То же для селезенки. c то же для почки. d то же для плазмы. e То же для плазмы на Т1

В подвздошной, толстой и слепой кишках и поджелудочной железе на протяжении всего исследования не наблюдалось значительных метаболических изменений в ответ на инфекцию.

К концу исследования дифференцировать метаболически инфицированных птиц от неинфицированных не удалось.

Лечение Тиамулином™ ослабляет метаболический ответ на инфекцию

Затем мы исследовали, модулирует ли Тиамулин™ метаболический ответ хозяина на инфекцию. На PM2 в ответ на инфекцию наблюдался более высокий уровень бетаина в плазме ( p — значение < 0,01 - Дополнительный файл 2). Однако у птиц, инфицированных и обработанных тиамулином™, уровень бетаина в плазме был таким же, как и у контрольной группы, хотя этот ответ не зависел от дозы.

В предыдущем разделе было описано, что инфекция вызывает падение уровня глюкозы в куриной плазме ( p -значение < 0.05 – Тест Уилкоксона-) в PM2, который частично облегчался лечением тиамулином™. Это не было полностью исправлено лечением тиамулином™, так как снижение уровня глюкозы в плазме все же было ниже, чем в контрольной группе ( p -значение < 0,05). Интересно, что уровни глюкозы в плазме были обратно пропорциональны дозе лечения (дополнительный файл 3).

Терапия тиамулином вызывает значительный сдвиг в метаболизме липидов

График PCA, показывающий общее влияние лечения на метаболические профили плазмы на PM2 (рис.а) выявили четкое разделение между оценками птиц, получавших Тиамулин™, и птиц, не получавших основного компонента 1 (ПК1). Действительно, множество птиц, получавших антибиотики, занимали метаболическое пространство, отличное от контрольных и инфицированных, но нелеченных птиц. Метаболические профили плазмы цыплят, получавших Тиамулин™, характеризовались повышенным уровнем липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) и сниженным уровнем липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) (рис. а, б и в). Линейная регрессия метаболических профилей в зависимости от дозы антибиотиков показала, что влияние на липопротеины зависело от дозы (дополнительный файл 4).

Тиамулин вызывает изменения метаболизма в плазме. график баллов PCA для первого (T1 48%) и четвертого (T4 5%) основных компонентов, полученный из модели, рассчитанной с использованием спектров 1d-ЯМР плазмы птиц при PM2. b Цветной график спектров 1D-ЯМР плазмы контрольных птиц (синий), инфицированных и необработанных птиц (розовый) и обработанных птиц (зеленый). c График загрузки основного компонента 1 (PC1), молекулы, направленные вверх, положительно коррелируют с PC1, молекулы, направленные вниз, отрицательно коррелируют с PC1. d График загрузки основного компонента 4 (PC4), молекулы, направленные вверх, положительно коррелируют с PC4, молекулы, направленные вниз, отрицательно коррелируют с PC4. e График показателей PCA, полученный на основе модели, рассчитанной с использованием спектров ЯМР 1 H HR-MAS, полученных из биоптатов интактной печени. f График нагрузок основного компонента 1 (PC1) модели PCA, представленной в E

Поскольку печень является центральным органом, регулирующим метаболизм холестерина и липидов, метаболические профили интактных биоптатов печени были созданы с использованием HR-MAS 1 Н-ЯМР спектроскопия.Этот анализ показал, что печень птиц, получавших Тиамулин™, была богаче липопротеинами, чем птицы, не получавшие лечения (рис. c и f), что свидетельствует о том, что печень секретировала больше ЛПОНП, и подтверждает влияние Тиамулина™ на центральный метаболизм липидов и холестерина.

Тиамулин™ ускоряет постпубертатный метаболический сдвиг

При изучении влияния тиамулина™ на метаболические профили плазмы цыплят в общем исследовании (все группы PM1, 2 и 3) выяснилось, что возраст также является сильным источником метаболических нарушений. вариация (рис.). Действительно, линейная регрессия, рассчитанная по метаболическим профилям плазмы с использованием возраста в качестве предиктора, показала хорошую модель, на что указывают сильные параметры (R 2 Y = 0,52, Q 2 Y = 0,51 и p -значение = 0,002). . Возраст птицы ассоциировался со снижением уровня ЛПВП, глюкозы, сукцината и лактата, в то время как уровень ЛПОНП повышался (рис. ). Анализ показателей (рис. b) показал, что птицы, получавшие тиамулин™, были метаболически сходны с птицами в постпубертатном периоде (PM3 = 19 недель) на PM2 (= 17 недель) и, наоборот, у нелеченных птиц метаболические профили были сходны с птицами. из препубертатной группы (PM1 = 16 недель).

Возраст связан с повышением ЛПОНП и снижением ЛПВП и уровня глюкозы. a Цветной график спектров 1D-ЯМР плазмы 16-недельных птиц (синий), 17-недельных птиц (красный) и 19-недельных птиц (черный). b График показателей регрессионной модели O-PLS, рассчитанных с использованием 1 H-ЯМР-спектров птиц во все моменты времени в качестве матрицы независимых переменных и возраста птиц в качестве предиктора. c График коэффициента регрессии O-PLS в зависимости от возраста птицы

Инфекция и Тиамулин™ изменили состав микробиоты слепой кишки

Состав популяции микробиоты слепой кишки был оценен в ответ на инфекцию и лечение Тиамулином™ с использованием 454 16S пиросеквенирования V4 -V5 гипервариабельные области.Популяция микробиоты слепой кишки была стабильной с течением времени в контрольной группе, как показано на графиках оценки PCA (рис. a–c и дополнительный файл 5).

Лечение тиамулином способствует глубокому изменению микробного разнообразия и популяции кишечника. a Графики показателей PCA, рассчитанные с использованием относительного процента численности бактерий на уровне семейства для всех птиц, но отображающие только показатели ( n  = 8) контрольных (синий кружок) и инфицированных птиц (розовый квадрат) после заражения (T0) . b Тот же график оценок PCA, что и для A, но отображающий только оценки ( n  = 8) контрольной группы (синий кружок), инфицированных птиц (розовый квадрат) и птиц, получавших самую высокую дозу (зеленые треугольники) после лечения (T1). c Тот же график оценки PCA, что и для A и B, но отображающий только оценки контрольной (синий кружок), зараженной птицы (розовый квадрат) и обработанной птицы (зеленые треугольники) через три недели после обработки (T2). d Альфа-разнообразие рассчитано для контрольных, инфицированных и обработанных птиц независимо от времени. e Круговая диаграмма, показывающая относительную численность бактерий на уровне типа для каждой группы (контрольная, инфицированная и получавшая лечение) для трех моментов времени, выбранных в этом исследовании

Инфекция была связана с модификацией комменсальной микробиоты слепой кишки по сравнению с контролем (рис. а и б), но к концу исследования баланс сообщества восстановился (рис. в). Эта модификация микробиоты слепой кишки в основном была связана с увеличением количества Lactobacillales, Burkholderiales и Campylobacterales, причем эти два последних порядка относятся к типу Proteobacteria (дополнительный файл 6).

После лечения Тиамулином™ класс Spirochaetes, к которому принадлежит B. pilosicoli , больше не обнаруживался с помощью подходов секвенирования 16S (рис. e). Тем не менее, этот класс бактерий снова появился через три недели после окончания лечения тиамулином™. Кроме того, в предыдущей публикации было показано, что при использовании более целенаправленных методов B. pilosicoli обнаруживались в каждой инфицированной группе на протяжении всего исследования [15]. Их относительный процент численности был выше, чем в обеих необработанных группах (до 25%), что, вероятно, связано с переходом бактерий в состояние покоя при лечении Тиамулином™ [16].

Используя MANOVA, мы заметили, что α-разнообразие в значительной степени связано с возрастом ( p -значение = 0,047) и лечением ( p -значение = 0,001), а также с взаимодействием между обоими факторами возраст*лечение (p-значение = 7,1*10 − 5 ). Как и ожидалось, дозировка антибиотика была связана с сильным снижением бактериального α-разнообразия по сравнению с контрольной и инфицированной группами на PM2 (значение p = 0,007 и 4,8*10 – 4 соответственно, рис. d). Однако к концу исследования α-разнообразие группы, получавшей лечение, было эквивалентно двум другим группам в тот же момент времени.Лечение тиамулином™ привело к значительному изменению β-разнообразия микробного сообщества слепой кишки (рис. b и дополнительный файл 5). Это было вызвано снижением относительной численности Firmicutes (с 30 до 22%) и увеличением доли Bacteroidetes (с 60 до 71%). Соотношение Firmicutes/Bacteroidetes было изменено приблизительно с 1:2 до 1:3. Хотя микробное разнообразие развивалось в течение трех недель после лечения Тиамулином™, оно не смогло вернуться к исходному составу к концу исследования и продолжало содержать относительно высокое относительное количество протеобактерий (рис.б и в).

Обсуждение

Несмотря на то, что было опубликовано несколько исследований [17–20], мало что известно о взаимосвязи между устойчивостью кишечной микробиоты при кишечных заболеваниях, ее восстановлением после лечения антибиотиками и общим влиянием на метаболизм хозяина. пробел в знаниях, который мотивировал это исследование. Желудочно-кишечные инфекции часто вызывают дисбактериоз микробиоты кишечника, как и лечение антибиотиками [21, 22]. Известно, что состав кишечной микробиоты играет важную роль в росте хозяина, а тяжелый дисбактериоз может быть причиной аномального развития [23, 24].Мы определили, что интервенционное исследование, направленное на оценку эффективности Тиамулина™ против АИС [15], позволит нам оценить, вызвано ли снижение скорости роста, связанное с инфекцией, дисбактериозом микробиоты слепой кишки. Мы предположили, что модификации кишечной микробиоты в результате инфекции приведут к модулированию метаболического гомеостаза хозяина, который был скорректирован в этом исследовании с помощью лечения тиамулином™. Материалы, используемые для этой статьи, были взяты из исследования, которое показало значительное снижение темпов роста среди других клинических последствий у кур-несушек в ответ на B.pilosicoli [15].

Инфекция привела к увеличению количества протеобактерий, многие из которых являются условно-патогенными микроорганизмами, связанными с повышенным риском диареи. Интересно, что обогащение Proteobacteria было связано с метаболическим синдромом [25]. Увеличение протеобактерий ранее наблюдалось в ответ на пенициллин у мышей, что было связано с увеличением массы тела, процента жировой массы и заболеваемостью диабетом [26].

В настоящем исследовании инфекция и бактериальный дисбиоз сопровождались глубокими системными метаболическими изменениями хозяина.Ряд пораженных инфекцией тканей (печень, селезенка, почки и плазма) свидетельствует о системной метаболической реакции организма на колонизацию и дисбактериоз. Интересно, что повышенные уровни глицерина были заметны во всех вышеупомянутых компартментах. Системное повышение уровня глицерина является маркером липолиза в жировых тканях, где триглицериды лизируются на свободные жирные кислоты и глицерин под действием ферментов липазы. Затем глицерин высвобождается в общий кровоток для использования в качестве предшественника глюкозы в печени и/или почках.Этот механизм обычно активируется длительным низким уровнем глюкозы в плазме. Кроме того, желудочно-кишечная инфекция может нарушать всасывание глюкозы из-за нарушения кишечного барьера, и, таким образом, возможно, что это явление также было вызвано снижением всасывания глюкозы в кишечнике. Известно, что B. pilosicoli сильно разрушает стенку кишечника [27], что также подтверждается наблюдением более высоких уровней глюкозы в фекалиях инфицированных птиц. Повышенное содержание полисахаридов в фекалиях также может быть связано со способностью B.pilosicoli для деградации муцина [28–30]. Кроме того, одновременное увеличение содержания бутирата и ацетата, наблюдаемое во время инфекции, свидетельствует о более высокой ферментации углеводов и, следовательно, об изменении метаболической активности ГМ. Концентрация глюкозы в плазме строго контролируется и регулируется, поскольку ее уровень необходимо поддерживать для поддержания основных функций, таких как мозговая и мышечная активность. Для поддержания уровня глюкозы глюконеогенез из глицерина активируется во время голодания, что требует накопления жира для высвобождения неэтерифицированных жирных кислот и глицерина в плазме.Это уменьшение жировой массы, вероятно, связано со снижением скорости роста, наблюдаемым у цыплят, колонизированных B. pilosicoli [15, 31]. Однако падение уровня глюкозы в плазме, наблюдаемое на PM2 после восстановления уровня глицерина, предполагает, что этот альтернативный метаболический путь не может поддерживать потребность в энергии в течение длительного времени.

Полное восстановление метаболического гомеостаза хозяина в ответ на инфекцию было достигнуто в конце исследования (PM3). Это совпало с чистым снижением процента инфицированных птиц во всех группах [15] и стабилизацией микробиоты слепой кишки.Следовательно, симптомы и заметные метаболические реакции хозяина на инфекцию возникали только при наличии дисбактериоза микробиоты. Такое наблюдение предполагает, что как присутствие патогена, так и модификация микробного сообщества кишечника необходимы для запуска метаболических реакций хозяина. Идея о том, что GM может действовать как буфер, регулирующий метаболический ответ хозяина на инфекцию патогеном, была частично исследована Khosravi et al. [32], которые показали, что инфекция Helicobacter pylori вызывала более сильный метаболический ответ хозяина (модификация уровней инсулина, грелина и лептина) у стерильных мышей, чем у обычных животных, и что вызванное инфекцией снижение скорости роста наблюдалось только в отсутствие ГМ.Эта толерантность к патогену была связана с тренировкой иммунной системы. Таким образом, инфекцию можно рассматривать как реакцию на изменение экосистемы, а не на колонизацию одним патогеном.

В этом наборе результатов Тиамулин™ был способен снижать индуцированный инфекцией метаболический ответ, повышать уровень бетаина и снижать уровень глюкозы в плазме. Хотя доза-эффект наблюдался на уровне инфекции, измеренном положительными мазками [15], это не было верно для уровней бетаина в плазме.Вероятно, повышение уровня бетаина в ответ на инфекцию связано с центральной осмопротекторной ролью этой молекулы [33]. Бетаин ранее использовался в качестве пищевой добавки для цыплят из-за его способности защищать кишечный барьер от патогенов, таких как Coccidia [34]. Действительно, инвазия клеток B. pilosicoli вызывает отек и нарушение осмотического баланса [9, 27]. Таким образом, повышенное количество бетаина (обычно поступающего из почек) может транспортироваться из других тканей к кишечному барьеру через общую циркуляцию, что объясняет его повышенный уровень в плазме.

Мы наблюдали, что нормальное «метаболическое старение» (снижение уровней ЛПВП/ЛПОНП и глюкозы в плазме), происходящее в период полового созревания, ускорялось при лечении тиамулином™. Интересно, что снижение соотношения ЛПВП/ЛПОНП и уровня глюкозы в общем кровотоке было связано с повышением уровня стероидных гормонов и, в частности, прогестерона [35–37]. Цитохром P450 3A (CYP3A, важное семейство ферментов, присутствующих в печени и участвующих в детоксикации лекарств) участвует в метаболизме стероидных гормонов (прогестерона, эстрогена и тестостерона).Кроме того, в нескольких исследованиях было показано, что снижение активности CYP3A обычно приводит к повышению концентрации стероидных гормонов в плазме [38–40]. Антибиотики — это активные молекулы, которые могут напрямую взаимодействовать с хозяином, если они способны преодолевать кишечный барьер. Сообщалось, что Тиамулин™ взаимодействует с CYP3A, образуя комплекс, который приводит к инактивации цитохрома in vitro и in vivo [41–44]. Таким образом, вполне вероятно, что наблюдаемый метаболический сдвиг в период до полового созревания является результатом взаимодействия Тиамулина™ с метаболизмом прогестерона.Это также подтверждается тем фактом, что начало яйцекладки, которое сильно зависит от созревания метаболизма стероидов, произошло раньше в двух группах, получавших самые высокие дозы Тиамулина™ [15]. В целом это подтверждает потенциальное взаимодействие Тиамулина™ с метаболизмом стероидов.

Наконец, сдвиг липопротеинов также может быть вызван модификациями микробиоты кишечника вследствие лечения антибиотиками. Метаболическое взаимодействие хозяин-ГМ широко исследовано. Действительно, во многих исследованиях сообщается, что ожирение и гомеостаз энергетического метаболизма тесно связаны с составом микробиоты кишечника [24, 45–47].Кроме того, было продемонстрировано, что использование антибиотиков до полового созревания у людей и мышей может быть связано с повышенным риском метаболических нарушений из-за модулирования микробиоты кишечника [26, 48, 49]. Интересно, что низкое соотношение Firmicutes/Bacteroidetes, как сообщается, связано с худощавым фенотипом и более низким риском развития нарушений, характеризующихся модификацией метаболизма холестерина [2, 50, 51]. Однако это противоречит нашим наблюдениям, которые предполагают, что обнаруженная модификация ЛПОНП/ЛПВП может быть вызвана самим тиамулином, а не модификациями микробиоты: является ли это общим явлением для некоторых или всех классов антибиотиков, несомненно, очень заслуживает будущего. изучать.Также мы должны помнить, что другие бактериальные изменения могут быть ответственны за модификацию метаболизма холестерина: действительно известно, что некоторые молочнокислые бактерии способны метаболизировать холестерин [52], и их использование в качестве кормовой добавки у цыплят-бройлеров приводило к снижению концентрации холестерина в плазме [52]. 53]. Следовательно, потребуются дальнейшие эксперименты, чтобы разделить эти аспекты.

Заключение

Эта работа демонстрирует, что состав микробиоты кишечника может быть связан с нарушениями системного метаболизма хозяина, которые приводят к фенотипическим изменениям.Мы наблюдали, что инфекция была связана с дисбактериозом, снижением усвоения питательных веществ и нарушением энергетического обмена хозяина, что приводило к значительному снижению скорости роста. Были идентифицированы два системных биомаркера инфекции: глицерин и бетаин. Повышение системного глицерина ясно иллюстрирует метаболическую адаптацию хозяина к кишечной инфекции, направленную на обеспечение достаточного количества энергии для выживания. Однако предположительно все же наблюдалось нарушение прибавки массы тела, поскольку глицерин, вероятно, поступал из жировой ткани.Кроме того, симптомы, связанные с колонизацией патогеном, наблюдались только в том случае, если они были связаны с микробным дисбиозом кишечника. Это открытие убедительно подтверждает потенциальную защитную роль микробиоты кишечника от условно-патогенных микроорганизмов. Это указывает на необходимость проведения дальнейших исследований для понимания экологического контекста, в котором патогенная бактерия может стать вредной для своего хозяина. В этом исследовании лечение антибиотиками уменьшало инфекцию и связанные с ней симптомы при одновременном изменении метаболизма холестерина.На основании наших результатов и ранее опубликованной работы мы выдвинули гипотезу о том, что метаболический ответ хозяина на лечение антибиотиками является результатом одновременной модификации состава кишечной микробиоты и метаболизма стероидов. Эти данные свидетельствуют о том, что влияние потребления антибиотиков на энергетический метаболизм хозяина следует изучать как ответ на прямое взаимодействие и через посредничество кишечной микробиоты. Наконец, антибиотик вызвал снижение α-разнообразия с последующим дисбактериозом, который может привести к большей уязвимости к колонизации патогеном и способствовать рецидиву.Следовательно, следует рассмотреть возможность лечения антибиотиками в сочетании с пищевыми добавками, такими как пре/про/симбиотики, для восстановления «более здоровой» кишечной микробиоты после вмешательства.

Методы

Изучение животных и план эксперимента

Кратко: 150 коммерческих кур-несушек NovoGen Brown в возрасте 16–17 недель, полученных от коммерческого поставщика (Tom Barron Ltd., Великобритания), содержали в APHA (Аддлстоун, Суррей, Великобритания). в соответствии с инструкциями Министерства внутренних дел (лицензия Министерства внутренних дел -PPL 70/7249-), и все процедуры проводились в соответствии с Законом о научных процедурах в отношении животных 1986 года.После исследования животных сжигали на месте, чтобы избежать риска заражения патогеном окружающей среды.

Экспериментальный план был описан ранее Woodward et al. [15] и для наглядности сведены на рис. Животных случайным образом распределяли по пяти группам ( n  = 30), получая следующие обработки: группа A: необработанные, неинфицированные контроли; Группа B: необработанные, инфицированные контроли; Группа C: инфицированные + тиамулин™ при 62,5 млн; Группа D: инфицированные + тиамулин™ при 125 мд; Группа E: инфицированные + тиамулин™ при 250 ppm.

После нейтрализации зоба птиц заражали через желудочный зонд 1 мл суспензии B. pilosicoli B2904 (5 × 10 9  КОЕ/мл) в течение пяти дней каждые два дня [54]. Через неделю после окончания заражения группы C, D и E получали различные концентрации тиамулина™ в питьевой воде в течение пяти дней. Затем птиц наблюдали в течение трех недель. Корм представлял собой нелекарственные гранулы несушек (Додсон и Хоррелл), а воду давали из водопровода, птицы имели доступ к обоим вволю.

Сбор образцов при исследовании на животных

Биопсии, образцы плазмы и фекалий были собраны во время патологоанатомического исследования в трех временных точках: на следующий день после окончания инфекционного процесса (PM1), на следующий день после окончания антибиотикотерапии лечения (РМ2) и в конце исследования (РМ3) (рис. а). Для каждой группы и момента времени случайным образом отбирали восемь птиц и проводили эвтаназию путем седативного действия с использованием смеси ромпун/кетамин в виде внутримышечной инъекции с последующей внутривенной инъекцией пентобарбитона.Кровь брали сначала из сердца, а сыворотку замораживали при - 80 °C после образования сгустка. Образцы биопсии ткани (приблизительно 1   г для всех тканей) и образцы фекалий, собранные непосредственно из кишечного тракта енота и слепой кишки (приблизительно 1   г), были быстро заморожены в жидком азоте, а затем сохранены при температуре - 80  °C для будущей оценки их метаболический состав и профиль микробиома слепой кишки.

Данные об общем влиянии инфекции и лечения Тиамулином™ на уровень инфекции, рост, состояние здоровья птиц (оценивается путем наблюдения за оперением птицы и развитием мускулатуры), яйценоскость, потребление воды и корма также приведены в вышеупомянутом статье [15] и здесь не повторяются.

Подготовка проб для ЯМР

Экстракцию полярных метаболитов почек, поджелудочной железы, селезенки и печени проводили путем гомогенизации 0,1 г ткани в 1 мл смеси 3:1 ( v /v) метанол/H 2 O с использованием раствора тканевый лизер [55]. После центрифугирования (10 мин при 12000×g) супернатанты высушивали в скоростном вакууме и ресуспендировали в 600 мкл фосфатного буфера (0,2М), содержащего 90% D 2 O и 10% H 2 O плюс 0,01%. 3-(триметилсилил)пропионат-2,3-d4 натрия (TSP используется в качестве внутреннего стандарта).Затем образцы (0,5 мл) переносили в 5 мм ЯМР-пробирки для сбора. Образцы плазмы смешивали с фосфатно-солевым буфером с 90% D2O в соотношении 2:1 (об./об.), затем 0,5 мл переносили в 5 мм пробирки для ЯМР. 0,0150 мкг биоптата печени добавляли с фосфатным буфером в центрифуге для твердотельной ЯМР-спектроскопии.

ЯМР-спектроскопия

Для тканей 1 Спектры Н-ЯМР были получены на спектрометре Bruker Advance 700 МГц с использованием стандартной импульсной программы noesypr1D с предварительным насыщением водой (задержка релаксации 2 с и время перемешивания 100 мс).Спектры 1D ЯМР плазмы были получены с использованием импульса Карра-Перселла-Мейбум-Гилла (CPMG). Биоптаты печени были получены на спектрометре Bruker Advance с частотой 500 МГц с использованием зонда 1 H HR MAS. Спектры были получены с использованием стандартного импульса noesypr1D, а также CPMG. Для всех матриц были проведены эксперименты 2D ЯМР на выбранных образцах, чтобы помочь идентифицировать метаболиты, а также ранее опубликованный атлас метаболизма цыплят [55]. Спектры были получены с использованием 256 сканирований с 16 фиктивными сканами (DS). Все спектры были записаны как 64 тыс. точек данных (15  м.д.).

Методы выделения ДНК для популяционных исследований на основе 16S

ДНК из образцов фекалий экстрагировали с использованием набора для выделения ДНК PowerSoil® ( MO BIO Laboratories, Inc) , приобретенного Qiagen. Для обеспечения качества образцов ДНК после экстракции была проведена ПЦР универсальной области V4-V5 16S рРНК (условия циклирования: 94°С в течение 3 мин; 30° циклов: 94°С в течение 30°с, 55°С в течение 45°с, 72°C в течение 1 мин, затем 72°C в течение 8 мин) и концентрацию оценивали с помощью капли Nano.Праймеры для ПЦР были следующими:

Секвенирование 16S следующего поколения

Аликвоты выделенной ДНК амплифицировали с универсальными праймерами для областей V4 и V5 гена 16S рРНК. Праймеры U515F (5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTA) и U927R (5′-CCCGYCAATTCMTTTTRAGT) были разработаны для обеспечения амплификации как бактериальных, так и архейных участков рибосомных генов [56]. Праймеры прямого слияния состояли из праймера A GS FLX Titanium и библиотечного ключа (5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG) вместе с одним из набора из восьми 10-основных мультиплексных идентификаторов (MID) (Roche Diagnostics Ltd., СОЕДИНЕННОЕ КОРОЛЕВСТВО). Праймеры для обратного слияния включали титановый праймер B GS FLX и библиотечный ключ (5’-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG). Амплификацию проводили с помощью полимеразы FastStart HiFi (Roche Diagnostics Ltd., Великобритания) при следующих условиях циклирования: 94°С в течение 3 мин; 25 циклов: 94 °C в течение 30 с, 55 °C в течение 45 с, 72 °C в течение 1 мин; затем 72 °C в течение 8 мин. Ампликоны очищали с использованием магнитных шариков Ampure XP (Beckman Coulter) и измеряли концентрацию каждого образца с использованием анализа Picogreen на основе флуоресценции (Invitrogen).Концентрации были нормализованы перед объединением образцов в партии до 16, каждая из которых впоследствии будет идентифицирована своим уникальным MID. Затем объединенные образцы подвергали однонаправленному секвенированию, начиная с прямого праймера, на платформе 454 GS FLX Titanium в соответствии с инструкциями производителя (Roche Diagnostics).

Конвейер Ampliconnoise [57] был использован для разделения набора данных на отдельные файлы для каждого образца в соответствии с используемыми адаптерами MID, а затем для удаления ошибок пиросеквенирования, ошибок ПЦР и химерных последовательностей.Для дальнейшего анализа оставляли только последовательности длиной более 400 оснований. Затем обработанные последовательности были классифицированы с использованием процесса выбора открытых эталонных OTU, реализованного в QIIME v1.9.1 (Caporaso, et al. 2010), по базе данных генов 16S рРНК Greengenes (http://greengenes.secondgenome.com/downloads/). Полученное распределение OTU по нескольким образцам было дополнительно проанализировано с использованием QIIME v1.9.1. обобщить распределения и исследовать альфа- и бета-разнообразие [58].

Статистический анализ

Для метабономического анализа после применения экспоненциального окна с расширением линии 0.3 Гц и преобразование Фурье, спектры индивидуально фазировали и корректировали по базовой линии в программе MestReNova (Mestrelab Research v.8.1.2). Затем спектры были импортированы в Matlab (Mathwork® v2013a), где они были откалиброваны по TSP (δ 0,00) для всех тканевых экстрактов, лактату (δ 1,33) для плазмы и протону H 1 α-глюкозы (δ 5,23) для биопсия печени. Спектры нормировались для каждой матрицы индивидуально с помощью метода вероятностных отношений [59]. Метаболические различия между образцами оценивали с помощью анализа основных компонентов (PCA).Этот шаг также использовался для удаления потенциальных выбросов, которые считались таковыми, если при регистрации не удалось получить спектр, сравнимый с другими образцами того же набора. Когда были выявлены интересующие групповые кластеры, ортогональная проекция на дискриминантный анализ латентной структуры (O-PLS DA) использовалась для оценки метаболических вариаций между группами с использованием спектров ЯМР в качестве матрицы независимых переменных и инфекции или лечения в качестве вектора прогнозирования. Алгоритм регрессионных моделей предоставлен компанией Korrigan Sciences Ltd.

Критерий Уилкоксона использовали для оценки значимости вариаций между группами в отношении массы тела и α-разнообразия с использованием R. Также был проведен тест MANOVA для определения влияния времени, инфекции и лечения на α-разнообразие на R (модель < − aov(α-разнообразие ~ время*инфекция*лечение). Наконец, из-за глубины секвенирования и метода мы решили провести анализ микробного сообщества на уровне семейства, а не на более низком таксономическом уровне. Статистический анализ проводился на нулевом завышенном логарифме преобразованное относительное изобилие.Всего было обнаружено 54 семейства, но только 40 присутствовали как минимум в 25% образцов. Бета-разнообразие на уровне семьи было выполнено путем расчета евклидова расстояния между особями.

Дополнительные файлы

Дополнительный файл 1: (14M, eps)

Инфекция изменяет метаболическую активность ГМ и содержание полисахаридов в просвете кишечника. (A) Баллы OPLS-DA по сравнению с перекрестно подтвержденными баллами, рассчитанными с использованием спектров фекальной воды групп A и B в PM2 и инфекции в качестве предиктора.(B) График загрузки, связанный с моделью OPLS-DA, описанной в A. (EPS 14763 kb)

Дополнительный файл 2: (615K, eps)

Уровень бетаина в плазме при PM2 для всех групп, A: контроль, B: Зараженные, C: инфицированные и пролеченные (62 ppm), D: инфицированные и пролеченные (125 ppm), E: инфицированные и пролеченные (250 ppm). * pv < 0,05; ** pv < 0,01. (EPS 614 kb)

Дополнительный файл 3: (601K, eps)

Уровень глюкозы в плазме при PM2 для всех групп, A: контроль, B: инфицированные, C: инфицированные и пролеченные (62 ppm), D: инфицированные и пролеченные (125 ppm), E: инфицированные и пролеченные (250 ppm).* pv < 0,05; ** pv < 0,01. (EPS 601 kb)

Дополнительный файл 4: (14M, eps)

Линейный ответ плазмы на лечебную дозу тиамулина. (A) График оценок в сравнении с перекрестно подтвержденными оценками регрессионной модели O-PLS, рассчитанными с использованием спектров H-ЯМР 1 птиц в PM2 в качестве матрицы независимых переменных и доз тиамулина в качестве предиктора. Параметры модели: R 2 Y = 0,48, Q 2 Y = 0,43 и p -значение = 0,01 (EPS 13970 кб)

Дополнительный файл 5 в процентах: (948K, eps05 относительное содержание) 900 OTU спирохет для каждой лечебной группы в ходе исследования.(EPS 948 kb)

Дополнительный файл 6: (2.0M, eps)

Нагрузки, связанные с графиком оценок PCA на рис., рассчитаны с использованием относительного количества OTU для всех образцов в качестве матрицы независимой переменной. А, нагрузки ПК1. B, Загрузка ПК2. (EPS 2121 КБ)

Дополнительный файл 8: (2.0K, csv)

Таблица S8 . Пример ключа и метаданных для дополнительного файла 7: таблица S7. (CSV 2 kb)

Благодарности

Авторы выражают благодарность Novartis за финансирование испытаний на животных.Мы также хотим поблагодарить сотрудников APHA и доктора Люка Дж. Мэппли за помощь в исследованиях in vivo, а также доктора Радослава Михала Ковальчика из Химико-аналитического центра (CAF) Университета Рединга за его помощь во время получения спектров 2D ЯМР. .

Финансирование

Мы признательны за поддержку компании Novartis, которая спонсировала исследование на животных, о котором сообщалось ранее [15], в рамках которого с разрешения были проведены эти дополнительные исследования.

Доступность данных и материалов

Данные о микробиоме, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью в Дополнительный файл 7: Таблица S7 [и Дополнительный файл 8 с образцом ключа для инфекции и лечения].Необработанные последовательности общедоступны в общедоступном хранилище EBI под регистрационным номером: PRJEB29134. Наборы метаболомных данных (спектры ЯМР), использованные и/или проанализированные в ходе текущего исследования, можно получить у соответствующего автора по обоснованному запросу.

Сокращения

ЛПВП липопротеинов высокой плотности
ЯМР Ядерный магнитный резонанс
О-PLS Д.А. Ортогональные проекции на латентные структуры дискриминантного анализа
РСА основного компонента Анализ
PM Post Mortl
VLDL
VLDL Очень низкая плотность Липопротеин

Взносы авторов

Исследование было разработано MJW, RMLR и SPC и образцами, собранными CLR.Получение ЯМР, статистика и анализ данных были проведены CLR, секвенирование следующего поколения и аннотация были выполнены RJE. Рукопись была составлена ​​CLR и проверена SPC, MJW, RMLR и RJE. Все авторы прочитали и одобрили рукопись.

Примечания

Утверждение этических норм и согласие на участие

Все процедуры проводились в соответствии с пересмотренным Законом о научных процедурах в отношении животных от 1986 г. в Великобритании и Директивой 2010/63ЕС в Европе, одобренной Агентством по охране здоровья животных и растений (APHA- https //www.gov.uk/government/organisations/animal-and-plant-health-agency/about/research#ethics-committee), а птиц содержали в соответствии с рекомендациями Министерства внутренних дел (лицензия Министерства внутренних дел -PPL 70/7249-). В этом исследовании использовались коммерческие куры-несушки NovoGen Brown, полученные от коммерческого поставщика (Tom Barron Ltd., Великобритания). Все эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями контрольного списка ПРИБЫТИЯ (Дополнительный файл 9).

Согласие на публикацию

Не применимо.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов в отношении этой работы.

Примечание издателя

Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

Ссылки

1. Хупер Л.В., Литтман Д.Р., Макферсон А.Дж. Взаимодействие микробиоты и иммунной системы. Наука. 2012;336(6086):1268–1273. doi: 10.1126/science.1223490. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]2. Лей Р.Е., Тернбо П.Дж., Кляйн С., Гордон Дж.И. Микробная экология: кишечные микробы человека, связанные с ожирением.Природа. 2006; 444:1022. doi: 10.1038/4441022a. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]3. Кани П.Д., Делзенн Н.М. Роль микробиоты кишечника в энергетическом обмене и метаболических заболеваниях. Курр Фарм Дез. 2009; 15:1546–1558. doi: 10.2174/138161209788168164. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]4. Клаус С.П., Эллеро С.Л., Бергер Б., Краузе Л., Бруттин А. и др. Индуцированное колонизацией микробное метаболическое взаимодействие между хозяином и кишечником. МБио. 2011;2:e00271–e00210. doi: 10.1128/mBio.00271-10. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]5.Спор А., Корен О., Лей Р. Раскрытие влияния окружающей среды и генотипа хозяина на микробиом кишечника. Nat Rev Microbiol. 2011;9:279. doi: 10.1038/nrmicro2540. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]6. Антарам В.К., Ли Э., Измаил А., Шарма А., Май В., Рэнд К.Х. и др. Дисбактериоз кишечника и истощение маслянообразующих бактерий при инфекции Clostridium difficile и нозокомиальной диарее. JCM. 2013;51(9):2884–2892. doi: 10.1128/JCM.00845-13. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]7.Schulfer AF, Battaglia T, Alvarez Y, Bijnens L, Ruiz VE, et al. Межпоколенческая передача нарушенной антибиотиками микробиоты усиливает колит у восприимчивых мышей. Нат микробиол. 2018;3:234. doi: 10.1038/s41564-017-0075-5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]8. Le Roy CI, Mappley LJ, La Ragione RM, Woodward MJ, Claus SP. Индуцированный Brachyspira pilosicoli кишечный спирохетоз птиц. Microb Ecol Health Дис. 2015;26:28853. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]9. Мэппли Л.Дж., Ла Раджоне Р.М., Вудворд М.Дж. Brachyspira и ее роль в кишечном спирохетозе птиц. Вет микробиол. 2014; 168: 245–260. doi: 10.1016/j.vetmic.2013.11.019. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 10. Дварс Р.М., Давелаар Ф.Г., Смит Х.Ф. Заражение родительских кур-бройлеров кишечными спирохетами птиц: влияние на яйценоскость и качество цыплят. Авиан Патол. 1993; 22: 693–701. doi: 10.1080/03079459308418957. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11. Поульсен С.М., Карлссон М., Йоханссон Л.Б., Вестер Б. Препараты плевромутилина тиамулин и валнемулин связываются с РНК в пептидилтрансферазном центре на рибосоме.Мол микробиол. 2001;41:1091–1099. doi: 10.1046/j.1365-2958.2001.02595.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 12. Pringle M, Landén A, Unnerstad HE, Molander B, Bengtsson B. Чувствительность к противомикробным препаратам свиней Brachyspira hyodysenteriae и Brachyspira pilosicoli , выделенных в Швеции в период с 1990 по 2010 год. Acta Vet Scand. 2012;54:54. дои: 10.1186/1751-0147-54-54. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]13. Стивенс CP, Хэмпсон DJ. Оценка тиамулина и линкомицина для лечения племенных бройлеров, экспериментально инфицированных кишечной спирохетой Brachyspira pilosicoli .Авиан Патол. 2002; 31: 299–304. doi: 10.1080/03079450220136501. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Burch DGS, Harding C, Alvarez R, Valks M. Лечение полевого случая кишечного спирохетоза птиц, вызванного Brachyspira pilosicoli , тиамулином. Авиан Патол. 2006; 35: 211–216. doi: 10.1080/03079450600711011. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Вудворд М.Дж., Мэппли Л., Ле Рой С., Клаус С.П., Дэвис П. и др. Применение Denagard® Tiamulin в питьевой воде для борьбы с инфекцией Brachyspira pilosicoli птицы-несушки.рез. вет. 2015;103:87–95. doi: 10.1016/j.rvsc.2015.09.015. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Le Roy CI, Passey JL, Woodward MJ, La Ragione RM, Claus SP. Метабономический анализ реакции Brachyspira pilosicoli на тиамулин показывает метаболическую активность, несмотря на значительное торможение роста. Анаэроб. 2017;45:71–77. doi: 10.1016/j.anaerobe.2017.03.018. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Lozupone CA, Stombaugh JI, Gordon JI, Jansson JK, Knight R. Разнообразие, стабильность и устойчивость микробиоты кишечника человека.Природа. 2012;489:220. doi: 10.1038/nature11550. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]18. Родригес Р.Р., Грир Р.Л., Донг Х, Д.Суза К.Н., Гурунг М. и др. Вызванные антибиотиками изменения микробиоты кишечника связаны с изменениями метаболизма глюкозы у здоровых мышей. Фронт микробиол. 2017;8:2306. doi: 10.3389/fmicb.2017.02306. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]19. Li J, Yang K, Ju T, Ho T, McKay CA, et al. Воздействие антибиотиков в раннем возрасте влияет на развитие островков поджелудочной железы и регуляцию метаболизма.Научный доклад 2017; 7: 41778. doi: 10.1038/srep41778. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]20. Детлефсен Л., Релман Д.А. Неполное восстановление и индивидуальная реакция микробиоты дистального отдела кишечника человека на повторное воздействие антибиотиков. ПНАС. 2001; 108 (Приложение 1): 4554–4561. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]21. Агилера М., Серда-Куэльяр М., Мартинес В. Дисбиоз, вызванный антибиотиками, изменяет взаимодействие хозяина и бактерий и приводит к сенсорным и моторным изменениям толстой кишки у мышей. Кишечные микробы.2015; 6:10–23. doi: 10.4161/194.2014.9

. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]22. Стечер Б., Майер Л., Хардт В.Д. «Цветение» в кишечнике: как дисбиоз может способствовать эволюции патогенов. Nat Rev Microbiol. 2013;11:277. doi: 10.1038/nrmicro2989. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Субраманиан С., Хук С., Яцуненко Т., Хак Р., Махфуз М. и др. Стойкая незрелость микробиоты кишечника у детей Бангладеш, страдающих от недоедания. Природа. 2014;510:417. doi: 10.1038/nature13421. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]24.Клаус СП. Борьба с недоеданием: не забывайте об ошибках. Клеточный микроб-хозяин. 2016;13:239–240. doi: 10.1016/j.chom.2013.02.015. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Тремароли В., Бекхед Ф. Функциональные взаимодействия между микробиотой кишечника и метаболизмом хозяина. Природа. 2012; 489:242. doi: 10.1038/nature11552. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 26. Кокс Л.М., Яманиши С., Сон Дж., Алексеенко А.В., Леунг Дж.М. и соавт. Изменение кишечной микробиоты во время критического окна развития имеет длительные метаболические последствия.Клетка. 2014; 158:705–721. doi: 10.1016/j.cell.2014.05.052. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]27. Мэппли Л.Дж., Чоржевска М.А., Кули В.А., Вудворд М.Дж., Ла Раджоне Р.М. Лактобациллы препятствуют росту, подвижности и прикреплению Brachyspira pilosicoli : потенциальное вмешательство против птичьего кишечного спирохетоза. АЕМ. 2011;77(15):5402–5411. doi: 10.1128/AEM.00185-11. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]28. Нареш Р., Хэмпсон DJ. Аттракцион Brachyspira pilosicoli к муцину.Микробиология. 2010; 156:191–197. doi: 10.1099/микрофон 0.030262-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Мэппли Л.Дж., Блэк М.Л., Абуун М., Дарби А.С., Вудворд М.Дж. и др. Сравнительная геномика штаммов Brachyspira pilosicoli : геномные перестройки, редукция и корреляция генетического комплемента с фенотипическим разнообразием. Геномика BMC. 2012;13:454. дои: 10.1186/1471-2164-13-454. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]31. Mappley LJ, Tchórzewska MA, Nunez A, Woodward MJ, Bramley PM, et al.Пероральное лечение цыплят Lactobacillus reuteri LM1 снижает патологию, индуцированную Brachyspira pilosicoli . ДжММ. 2013; 62: 287–296. [PubMed] [Google Scholar] 32. Хосрави Ю., Бунте Р.М., Чиоу К.Х., Тан Т.Л., Вонг В.Ю. и др. Helicobacter pylori и микробиота кишечника модулируют энергетический гомеостаз, прежде чем вызвать гистопатологические изменения у мышей. Кишечные микробы. 2016;7:48–53. doi: 10.1080/194.2015.1119990. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]33.Фелицкий Д.Дж., Кэннон Дж.Г., Капп М.В., Хонг Дж., Ван Винсберг А.В. и др. Исключение бетаина глицина с поверхности анионного биополимера: почему бетаин глицина является эффективным осмопротектором, но также и совместимым растворенным веществом. Биохимия. 2004;43:14732–14743. дои: 10.1021/bi049115w. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 34. Крейг С.А. Бетаин в питании человека. Am J Clin Nutr. 2004; 80: 539–549. doi: 10.1093/ajcn/80.3.539. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 35. Кушваха Р.С., Льюис Д.С., Кэри К.Д., JrHC MG. Влияние эстрогена и прогестерона на липопротеины плазмы и экспериментальный атеросклероз у павианов ( Papio sp. ) Тромб атеросклероза. 1991; 11: 23–31. doi: 10.1161/01.ATV.11.1.23. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 36. Судья С.М., Чаттертон РТ. Прогестерон-специфическая стимуляция биосинтеза триглицеридов в клеточной линии рака молочной железы (T-47D) Cancer Res. 1983; 43:4407–4412. [PubMed] [Google Scholar] 37. Сакс FM, Уолш Б.В. Влияние половых гормонов на липопротеины сыворотки крови: нерешенные вопросы биологии и клинической практики. Энн Н.Ю. Академия наук. 1990; 592: 272–285. doi: 10.1111/j.1749-6632.1990.tb30339.Икс. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 38. Нацухори М., ван Раак М., Лигтенберг М., Клей Л., тен Берге Д. и др. Выделение последовательности кДНК полноразмерного цитохрома P450 (CYP3A) крупного рогатого скота и ее функциональная экспрессия в клетках V79. Environ Toxicol Pharmacol. 1997; 3:17–24. doi: 10.1016/S1382-6689(96)00133-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 39. Бертилссон Г., Хайдрих Дж., Свенссон К., Осман М., Джендеберг Л. и др. Идентификация ядерного рецептора человека определяет новый сигнальный путь для индукции CYP3A.ПНАС. 1998;95:12208–12213. doi: 10.1073/pnas.95.21.12208. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]40. Лемли К.О., Батлер С.Т., Батлер В.Р., Уилсон М.Э. Инсулин изменяет катаболические ферменты прогестерона в печени цитохрома Р450 2С и 3А у молочных коров. JDS. 2008; 91: 641–645. [PubMed] [Google Scholar]41. Виткамп Р.Ф., Неймейер С.М., Ван Мирт А.С. Образование комплекса цитохрома Р-450 в печени крыс под действием антибиотика тиамулина. Противомикробные агенты Chemother. 1996;40:50–54. doi: 10.1128/AAC.40.1.50. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]42.Де Гроен Э.М., Неймейер С.М., Хорбах Г.Дж., Виткамп Р.Ф. Тиамулин ингибирует активность CYP3A4 человека в клеточной линии NIH/3T3, стабильно экспрессирующей кДНК CYP3A4. Биохим Фармакол. 1995; 50: 771–773. doi: 10.1016/0006-2952(95)00197-8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]43. Zweers-Zeilmaker WM, Van Miert AS, Horbach GJ, Witkamp RF. Комплексообразование in vitro и ингибирование активности цитохрома Р450 печени различными макролидами и тиамулином у коз и крупного рогатого скота. рез. вет. 1999; 66: 51–55. doi: 10.1053/rvsc.1998.0239. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]44. Ratz V, Laczay P, Mora ZS, Csiko GY, Monostori K, et al. Недавние исследования влияния тиамулина и монензина на активность цитохрома Р450 в печени у кур и индеек. J Vet Pharmacol Ther. 1997; 20: 415–418. doi: 10.1046/j.1365-2885.1997.00092.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]45. Муссо Г., Гамбино Р., Кассадер М. Взаимодействия между микробиотой кишечника и метаболизмом хозяина, предрасполагающие к ожирению и диабету. Анну Рев Мед. 2011;62:361–380. дои: 10.1146/аннурев-мед-012510-175505. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]46. Эверард А., полицейский Кани. Сахарный диабет, ожирение и микробиота кишечника. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2013; 27:73–83. doi: 10.1016/j.bpg.2013.03.007. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]47. Ларсен Н., Вогенсен Ф.К., ван ден Берг Ф.В., Нильсен Д.С., Андреасен А.С. и соавт. Микробиота кишечника у взрослых людей с диабетом 2 типа отличается от таковой у взрослых без диабета. ПЛОС Один. 2010;5:e9085. doi: 10.1371/journal.pone.0009085. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]48.Чо И., Яманиши С., Кокс Л., Мете Б.А., Завадил Дж. и др. Антибиотики в раннем возрасте изменяют микробиом толстой кишки мышей и ожирение. Природа. 2012; 488:621. doi: 10.1038/nature11400. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]49. Trasande L, Blustein J, Liu M, Corwin E, Cox LM, et al. Воздействие антибиотиков на младенцев и масса тела в раннем возрасте. Инт Дж. Обес. 2013;37:16. doi: 10.1038/ijo.2012.132. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]50. Ley RE, Bäckhed F, Turnbaugh P, Lozupone CA, Knight RD, et al.Ожирение изменяет микробную экологию кишечника. ПНАС. 2005; 102:11070–11075. doi: 10.1073/pnas.0504978102. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]51. Тернбо П.Дж., Лей Р.Е., Маховальд М.А., Магрини В., Мардис Э.Р. и др. Связанный с ожирением кишечный микробиом с повышенной способностью собирать энергию. Природа. 2006; 444:1027. doi: 10.1038/nature05414. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]52. Перейра Д.И., Гибсон Г.Р. Ассимиляция холестерина молочнокислыми бактериями и бифидобактериями, выделенными из кишечника человека.Appl Environ Microbiol. 2002; 68: 4689–4693. doi: 10.1128/AEM.68.9.4689-4693.2002. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]53. Джин Л.З., Хо Ю.В., Абдулла Н., Джалалудин С. Показатели роста, кишечные микробные популяции и уровень холестерина в сыворотке бройлеров, получавших рацион, содержащий культур Lactobacillus . Poult Sci. 1998; 77: 1259–1265. doi: 10.1093/ps/77.9.1259. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]54. Мэппли Л.Дж., Чоржевска М.А., Нуньес А., Вудворд М.Дж., Ла Рагионе Р.М. Доказательства системного распространения потенциально зоонозной кишечной спирохеты Brachyspira pilosicoli у экспериментально зараженных кур-несушек.J Med Microbiol. 2013; 62: 297–302. doi: 10.1099/jmm.0.052126-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]55. Le Roy CI, Mappley LJ, La Ragione RM, Woodward MJ, Claus SP. Метаболическая характеристика куриных тканей и биожидкостей на основе ЯМР: модель для исследования птиц. Метаболомика. 2016;12:157. doi: 10.1007/s11306-016-1105-7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]56. Эллис Р.Дж., Брюс К.Д., Дженкинс С., Стотард Дж.Р., Аджарова Л. и др. Сравнение микробиоты дистального отдела кишечника людей и животных в Африке.ПЛОС Один. 2013;8:e54783. doi: 10.1371/journal.pone.0054783. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]58. Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, Bittinger K, Bushman FD, et al. QIIME позволяет анализировать данные секвенирования с высокой пропускной способностью. Нат Методы. 2010;7:335. doi: 10.1038/nmeth.f.303. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]59. Гаваган С.Л., Уилсон И.Д., Николсон Дж.К. Физиологическая вариация в метаболическом фенотипировании и функциональных геномных исследованиях: использование коррекции ортогонального сигнала и PLS-DA.ФЭБС лат. 2002; 530:191–196. doi: 10.1016/S0014-5793(02)03476-2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Лечение антибиотиками вызывает дисбактериоз кишечника и модулирует метаболизм в куриной модели желудочно-кишечной инфекции

BMC Vet Res. 2019; 15: 37.

,

, 1, 2 ,
2 , 1 , 3 , , 3 , 4 1

0 1

Caroline Ivanne Le Roy

1 Департамент пищевых и пищевых наук, University of Reading, Whiteknights, Reading, RG6 6AP UK

2 Текущий адрес: Департамент исследований близнецов и генетической эпидемиологии, King’s College London, London, SE1 7EH UK

Martin John Woodward

1 Департамент пищевых продуктов и Науки о питании, Университет Рединга, Уайтнайтс, Рединг, RG6 6AP UK

Richard John Ellis

3 Центральный отдел секвенирования, Агентство по охране здоровья животных и растений, Addlestone, Surrey, KT15 3NB UK

Roberto Marcello La Ragione

2 4 Факультет здоровья и медицинских наук, Школа ветеринарной медицины, Университет Суррея, Гилфорд, Суррей, GU2 7AL UK

Sandrine Paule Claus

1 Факультет наук о пищевых продуктах и ​​питании, Университет Рединга, Уайтнайтс, Рединг, RG6 6AP UK

1 Департамент наук о пищевых продуктах и ​​питании, Университет Рединга, Уайтнайтс, Рединг, RG6 6AP UK

2 Настоящее время Адрес: Департамент исследований близнецов и генетической эпидемиологии, Королевский колледж Лондона, Лондон, SE1 7EH UK

3 Центральный отдел секвенирования, Агентство здоровья животных и растений, Addlestone, Surrey, KT15 3NB UK

4 Факультет здравоохранения и Медицинские науки, Школа ветеринарной медицины, Университет Суррея, Гилфорд, Суррей, GU2 7AL UK

Автор, ответственный за переписку.

Поступила в редакцию 14 сентября 2018 г.; Принято 21 декабря 2018 г.

Открытый доступ Эта статья распространяется в соответствии с условиями международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что вы укажете автора(ов) оригинала и источник, предоставите ссылку на лицензию Creative Commons и укажете, были ли внесены изменения. Отказ от права Creative Commons на общественное достояние (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) относится к данным, доступным в этой статье, если не указано иное. Эта статья цитировалась в других статьях в PMC.
Дополнительные материалы

Дополнительный файл 1: Инфекция изменяет метаболическую активность ГМ и содержание полисахаридов в просвете кишечника. (A) Баллы OPLS-DA по сравнению с перекрестно подтвержденными баллами, рассчитанными с использованием спектров фекальной воды групп A и B в PM2 и инфекции в качестве предиктора. (B) График загрузки, связанный с моделью OPLS-DA, описанной в A.(EPS 14763 kb)

GUID: 637A03F0-C80E-4205-91CF-62195461F463

Дополнительный файл 2: Уровень бетаина в плазме при PM2 для всех групп, A: контрольная, B: инфицированные, C: инфицированные и получавшие лечение ( 62 ppm), D: инфицированные и пролеченные (125 ppm), E: инфицированные и пролеченные (250 ppm). * pv < 0,05; ** pv < 0,01. (EPS 614 КБ)

GUID: 4147F990-2E35-44CF-9D0F-E210F590E478

Дополнительный файл 3: Уровень глюкозы в плазме при PM2 для всех групп, A: контроль, B: инфицированные, C: инфицированные и получавшие лечение (62 D: инфицированные и пролеченные (125 ppm), E: инфицированные и пролеченные (250 ppm).* pv < 0,05; ** pv < 0,01. (EPS 601 kb)

GUID: A8EC82A4-CC5F-4CA2-B276-BB70050B5A57

Дополнительный файл 4: Линейный ответ плазмы на лечебную дозу тиамулина. (A) График оценок в сравнении с перекрестно подтвержденными оценками регрессионной модели O-PLS, рассчитанными с использованием спектров H-ЯМР 1 птиц в PM2 в качестве матрицы независимых переменных и доз тиамулина в качестве предиктора. Параметры модели: R 2 Y = 0,48, Q 2 Y = 0,43 и p -значение = 0.01 (EPS 13970 kb)

GUID: 6ABCB568-5DB8-4C8B-A3E5-E06A18F2EDEA

Дополнительный файл 5: Относительная численность OTU спирохет в процентах для каждой лечебной группы в ходе исследования. (EPS 948 КБ)

GUID: 6204AE20-8C5E-4D76-B50E-F36A367FD54A

Дополнительный файл 6: Переменная. А, нагрузки ПК1. B, Загрузка ПК2.(EPS 2121 КБ)

GUID: 5CE26145-34C9-428F-A47D-5808CAFBF10B

Дополнительный файл 7: Таблица S7 . Таблица количества необработанных чтений OTU. (CSV 3322 КБ)

GUID: 58B61D3D-DD60-4F43-A35F-D47A593AF3EA

Дополнительный файл 8: Таблица S8 . Пример ключа и метаданных для дополнительного файла 7: таблица S7. (CSV, 2 КБ)

GUID: E93301B8-46A1-4F6B-BBDA-2B41D7B09EC1

Дополнительный файл 9: Дополнительный материал S9. чек-лист ПРИБЫТИЯ. (PDF, 1067 КБ)

GUID: 8BC7A496-0DC5-45E7-B489-E0D0C6C1AC58

Заявление о доступности данных

S7 [и Дополнительный файл 8 с образцом ключа для заражения и лечения].Необработанные последовательности общедоступны в общедоступном хранилище EBI под регистрационным номером: PRJEB29134. Наборы метаболомных данных (спектры ЯМР), использованные и/или проанализированные в ходе текущего исследования, можно получить у соответствующего автора по обоснованному запросу.

Abstract

История вопроса

Заражение пищеварительного тракта желудочно-кишечными патогенами приводит к развитию симптомов от легкой диареи до более тяжелых клинических признаков, таких как дизентерия, сильное обезвоживание и, возможно, смерть.Хотя антибиотики эффективны для борьбы с инфекциями, они также вызывают дисбактериоз, который, как предполагается, приводит к изменению прибавки в весе в системах животноводства.

Результаты

Это первое исследование, демонстрирующее метаболическое влияние инфекции желудочно-кишечного тракта ( Brachyspira pilosicoli ) и его устранение с помощью лечения антибиотиками (тиамулин) на системный метаболизм хозяина (курицы) и состав кишечной микробиоты с использованием спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения 1 H и секвенирование нового поколения 16S рДНК (NGS).Были идентифицированы четкие системные метаболические маркеры инфекций, такие как глицерин и бетаин. Потеря веса у нелеченых животных частично объяснялась наблюдением модификации системного энергетического метаболизма хозяина, характеризующейся использованием глицерина в качестве предшественника глюкозы. Тем не менее, лечение антибиотиками вызвало повышение соотношения ЛПОНП/ЛПВП в плазме, что может способствовать уменьшению потери веса, наблюдаемой у обработанных птиц. Все метаболические реакции сопровождались значительным сдвигом микробиоты при инфекции или лечении антибиотиками.

Заключение

Это исследование показывает, что инфекция и лечение антибиотиками вызывают дисбактериоз, который может повлиять на системный энергетический метаболизм хозяина и вызвать изменения фенотипа и состояния здоровья.

Электронный дополнительный материал

Электронная версия этой статьи (10.1186/s12917-018-1761-0) содержит дополнительные материалы, доступные авторизованным пользователям.

Ключевые слова: Микробиота, метаболизм, антибиотик, энергия, дисбиоз

Предыстория

Известно, что состав кишечной микробиоты (ГМ) оказывает сильное влияние на здоровье хозяина посредством широкого спектра механизмов, начиная от контроля иммунных функций [1], метаболических гомеостаз [2, 3] и метаболизм лекарственных средств [4].Даже если в целом стабильный внутри вида состав GM сильно зависит от воздействия окружающей среды (питание, ксенобиотики и инфекции), и любая модификация этой экосистемы может повлиять на здоровье хозяина, изменяя симбиотические отношения, существующие между хозяином и его кишечными микробами [5]. . Например, присутствие условно-патогенного микроорганизма в пищеварительном тракте может протекать бессимптомно, но также вызывать серьезные нарушения здоровья. Кроме того, инфекция, как правило, связана с бактериальным дисбиозом в пищеварительном тракте [6], но влияние такой модификации на метаболизм хозяина и развитие таких симптомов, как потеря веса, до сих пор плохо изучено.Улучшение симптомов обычно наблюдается после лечения антибиотиками за счет уменьшения количества патогенных бактерий и уменьшения последствий их инфекции. Однако использование антибиотиков также связано с уменьшением разнообразия GM, что связано с дальнейшим ослаблением метаболизма хозяина [7].

Кишечный спирохетоз птиц (ККИ) вызывается колонизацией нижних отделов пищеварительного тракта птиц возбудителем Brachyspira pilosicoli (тип Spirochaetes; класс Spirochaetes; отряд Spirochaetales; семейство Bracyspiraceae) [8, 9].Бактерия прикрепляется к клеточной стенке и может вызвать диарею, связанную со снижением скорости роста и производства яиц [10]. Наиболее распространенным средством, используемым для борьбы с инфекцией, является тиамулин™, антибиотик семейства плевромутилина, который ингибирует синтез белка путем связывания с 50S-областью рибосомы [11, 12]. Лишь несколько исследований оценили его эффективность у цыплят, несмотря на его интенсивное использование для лечения птичьих стад в промышленности [13, 14]. На сегодняшний день это заболевание и его лечение мало изучены и остаются малоизученными.Действительно, причина таких симптомов, как потеря веса и снижение яйценоскости, до сих пор неясна. В недавнем исследовании [15] была оценена эффективность трех доз Тиамулина™ для лечения кур-несушек, перорально зараженных B. pilosicoli B2904, и было установлено, что инфекция была связана со снижением скорости роста и что птицы, получавшие Тиамулин™, выздоравливали от инфекции независимо от использованной дозы, в то время как поддержание массы тела наблюдалось только в ответ на две самые высокие дозы. Кроме того, Тиамулин™ значительно уменьшал другие симптомы, связанные с инфекцией, а также системное распространение B.пилосиколи . Тем не менее, через три недели после прекращения лечения антибиотиками все еще наблюдалась колонизация пищеварительного тракта возбудителем. Таким образом, мы пришли к выводу, что это исследование представляет собой интересную модель инфекции для понимания реакции системного метаболизма и микробиоты кишечника хозяина на колонизацию пищеварительного тракта патогеном. Кроме того, план эксперимента позволяет проводить продольное исследование влияния лечения антибиотиками на суперорганизм (то есть на хозяина и микробиоту его кишечника).В этой статье мы представляем результаты, полученные после анализа образцов биопсии и биожидкости, собранных в ходе предыдущего исследования [15]. Для оценки системного метаболического ответа хозяина на инфекцию и лечение антибиотиками мы использовали метаболомику на основе 1 Н-ЯМР, которая позволяет нецелевую оценку метаболических колебаний, происходящих в биологических системах. Поскольку микробиота кишечника неразрывно связана с метаболическими реакциями хозяина, ее состав в ответ на инфекцию и лечение контролировали с помощью секвенирования гена 16S рРНК (16S NGS).Оба анализа позволили по-новому взглянуть на влияние инфекции и лечения антибиотиками на здоровье хозяина, объяснив физиологическую реакцию как на бактериальное, так и на химическое воздействие.

Результаты

Инфекция и лечение антибиотиками влияют на рост и яйценоскость

Влияние инфекции и яйценоскости отслеживали на протяжении всего исследования во всех группах (A, контрольная; B только инфицированные; CE, инфицированные и получавшие Тиамулин™ от самой низкой до максимальная доза). Заражение B.pilosicoli приводил к значительному снижению скорости роста (рис. б), но к концу исследования цыплята из группы Б (зараженные) весили меньше, чем птицы из группы А (контроль), но этот результат не был значимым. Две самые высокие дозы Тиамулина™ (группа D и E) были способны поддерживать рост цыплят, поскольку к концу исследования птицы из этих двух групп имели более высокий вес, чем в контрольной группе, и этот показатель был значительно выше, чем в инфицированной группе ( p -значение < 0.05). Однако у животных, получавших самую низкую дозу (группа C), средний вес в конце исследования был аналогичен весу инфицированной группы (B) и значительно отличался от трех других (A, D и E). . Это предполагает, что только более высокие дозы антибиотиков связаны с поддержанием скорости роста во время инфекции.

Экспериментальный план ( a ) и масса тела птицы ( b )

Инфекция вызывает системный метаболический ответ хозяина

Системный метаболический ответ на инфекцию B.pilosicoli наблюдали сразу после окончания периода заражения (день 6). O-PLS-DA показал, что инфекция была связана с модификацией метаболомов почек, печени, селезенки и плазмы (рис. a, b, c и d). Печень инфицированных птиц была богаче глицерином, лактатом, холином, сукцинатом и ацетатом (рис. а). В селезенке инфекция привела к снижению O -фосфохолина, глутамина и АМФ и повышению уровня глицерина, урацила, цитидина и лейцина (рис. б). В почках инфекция вызывала увеличение содержания глицерина, урацила и ксантина при одновременном снижении содержания инозина (рис.в). Повышенное содержание бетаина и глицерина также было связано с инфекцией в плазме (рис. d). После заражения (PM1) содержимое толстой кишки инфицированных птиц было богаче полисахаридами и аминокислотами (дополнительный файл 1). Через две недели после окончания периода заражения (PM2) почки, печень и селезенка инфицированных, но не леченых птиц восстановили свой метаболический гомеостаз (больше не было обнаруживаемых метаболических различий между контрольной и любой другой группой), что указывает на отсутствие метаболические изменения наблюдались в ответ на инфекцию.Однако уровень глюкозы в плазме зараженных птиц снизился (рис. д) примерно на 50%.

Инфекция B. pilosicoli связана с основными изменениями системного метаболизма. a Графики баллов (правая панель) и нагрузки (левая панель) модели O-PLS-DA, рассчитанные с использованием спектров 1D-ЯМР печени птиц при PM1 в качестве матрицы независимых переменных и инфекции в качестве предиктора инфицированных птиц (красный квадрат) и неинфицированные птицы (синий кружок). Форма графиков нагрузки представляет собой среднее стандартное отклонение всех спектров ЯМР, полученных для данной модели, и умноженное на вес модели O-PLS DA, что позволяет визуализировать, связаны ли метаболиты с инфекцией положительно (указывая вниз) или отрицательно (указывая вверх).Цветовая шкала представляет уровень корреляции между каждой точкой данных и заражением. b То же для селезенки. c то же для почки. d то же для плазмы. e То же для плазмы на Т1

В подвздошной, толстой и слепой кишках и поджелудочной железе на протяжении всего исследования не наблюдалось значительных метаболических изменений в ответ на инфекцию.

К концу исследования дифференцировать метаболически инфицированных птиц от неинфицированных не удалось.

Лечение Тиамулином™ ослабляет метаболический ответ на инфекцию

Затем мы исследовали, модулирует ли Тиамулин™ метаболический ответ хозяина на инфекцию. На PM2 в ответ на инфекцию наблюдался более высокий уровень бетаина в плазме ( p — значение < 0,01 - Дополнительный файл 2). Однако у птиц, инфицированных и обработанных тиамулином™, уровень бетаина в плазме был таким же, как и у контрольной группы, хотя этот ответ не зависел от дозы.

В предыдущем разделе было описано, что инфекция вызывает падение уровня глюкозы в куриной плазме ( p -значение < 0.05 – Тест Уилкоксона-) в PM2, который частично облегчался лечением тиамулином™. Это не было полностью исправлено лечением тиамулином™, так как снижение уровня глюкозы в плазме все же было ниже, чем в контрольной группе ( p -значение < 0,05). Интересно, что уровни глюкозы в плазме были обратно пропорциональны дозе лечения (дополнительный файл 3).

Терапия тиамулином вызывает значительный сдвиг в метаболизме липидов

График PCA, показывающий общее влияние лечения на метаболические профили плазмы на PM2 (рис.а) выявили четкое разделение между оценками птиц, получавших Тиамулин™, и птиц, не получавших основного компонента 1 (ПК1). Действительно, множество птиц, получавших антибиотики, занимали метаболическое пространство, отличное от контрольных и инфицированных, но нелеченных птиц. Метаболические профили плазмы цыплят, получавших Тиамулин™, характеризовались повышенным уровнем липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) и сниженным уровнем липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) (рис. а, б и в). Линейная регрессия метаболических профилей в зависимости от дозы антибиотиков показала, что влияние на липопротеины зависело от дозы (дополнительный файл 4).

Тиамулин вызывает изменения метаболизма в плазме. график баллов PCA для первого (T1 48%) и четвертого (T4 5%) основных компонентов, полученный из модели, рассчитанной с использованием спектров 1d-ЯМР плазмы птиц при PM2. b Цветной график спектров 1D-ЯМР плазмы контрольных птиц (синий), инфицированных и необработанных птиц (розовый) и обработанных птиц (зеленый). c График загрузки основного компонента 1 (PC1), молекулы, направленные вверх, положительно коррелируют с PC1, молекулы, направленные вниз, отрицательно коррелируют с PC1. d График загрузки основного компонента 4 (PC4), молекулы, направленные вверх, положительно коррелируют с PC4, молекулы, направленные вниз, отрицательно коррелируют с PC4. e График показателей PCA, полученный на основе модели, рассчитанной с использованием спектров ЯМР 1 H HR-MAS, полученных из биоптатов интактной печени. f График нагрузок основного компонента 1 (PC1) модели PCA, представленной в E

Поскольку печень является центральным органом, регулирующим метаболизм холестерина и липидов, метаболические профили интактных биоптатов печени были созданы с использованием HR-MAS 1 Н-ЯМР спектроскопия.Этот анализ показал, что печень птиц, получавших Тиамулин™, была богаче липопротеинами, чем птицы, не получавшие лечения (рис. c и f), что свидетельствует о том, что печень секретировала больше ЛПОНП, и подтверждает влияние Тиамулина™ на центральный метаболизм липидов и холестерина.

Тиамулин™ ускоряет постпубертатный метаболический сдвиг

При изучении влияния тиамулина™ на метаболические профили плазмы цыплят в общем исследовании (все группы PM1, 2 и 3) выяснилось, что возраст также является сильным источником метаболических нарушений. вариация (рис.). Действительно, линейная регрессия, рассчитанная по метаболическим профилям плазмы с использованием возраста в качестве предиктора, показала хорошую модель, на что указывают сильные параметры (R 2 Y = 0,52, Q 2 Y = 0,51 и p -значение = 0,002). . Возраст птицы ассоциировался со снижением уровня ЛПВП, глюкозы, сукцината и лактата, в то время как уровень ЛПОНП повышался (рис. ). Анализ показателей (рис. b) показал, что птицы, получавшие тиамулин™, были метаболически сходны с птицами в постпубертатном периоде (PM3 = 19 недель) на PM2 (= 17 недель) и, наоборот, у нелеченных птиц метаболические профили были сходны с птицами. из препубертатной группы (PM1 = 16 недель).

Возраст связан с повышением ЛПОНП и снижением ЛПВП и уровня глюкозы. a Цветной график спектров 1D-ЯМР плазмы 16-недельных птиц (синий), 17-недельных птиц (красный) и 19-недельных птиц (черный). b График показателей регрессионной модели O-PLS, рассчитанных с использованием 1 H-ЯМР-спектров птиц во все моменты времени в качестве матрицы независимых переменных и возраста птиц в качестве предиктора. c График коэффициента регрессии O-PLS в зависимости от возраста птицы

Инфекция и Тиамулин™ изменили состав микробиоты слепой кишки

Состав популяции микробиоты слепой кишки был оценен в ответ на инфекцию и лечение Тиамулином™ с использованием 454 16S пиросеквенирования V4 -V5 гипервариабельные области.Популяция микробиоты слепой кишки была стабильной с течением времени в контрольной группе, как показано на графиках оценки PCA (рис. a–c и дополнительный файл 5).

Лечение тиамулином способствует глубокому изменению микробного разнообразия и популяции кишечника. a Графики показателей PCA, рассчитанные с использованием относительного процента численности бактерий на уровне семейства для всех птиц, но отображающие только показатели ( n  = 8) контрольных (синий кружок) и инфицированных птиц (розовый квадрат) после заражения (T0) . b Тот же график оценок PCA, что и для A, но отображающий только оценки ( n  = 8) контрольной группы (синий кружок), инфицированных птиц (розовый квадрат) и птиц, получавших самую высокую дозу (зеленые треугольники) после лечения (T1). c Тот же график оценки PCA, что и для A и B, но отображающий только оценки контрольной (синий кружок), зараженной птицы (розовый квадрат) и обработанной птицы (зеленые треугольники) через три недели после обработки (T2). d Альфа-разнообразие рассчитано для контрольных, инфицированных и обработанных птиц независимо от времени. e Круговая диаграмма, показывающая относительную численность бактерий на уровне типа для каждой группы (контрольная, инфицированная и получавшая лечение) для трех моментов времени, выбранных в этом исследовании

Инфекция была связана с модификацией комменсальной микробиоты слепой кишки по сравнению с контролем (рис. а и б), но к концу исследования баланс сообщества восстановился (рис. в). Эта модификация микробиоты слепой кишки в основном была связана с увеличением количества Lactobacillales, Burkholderiales и Campylobacterales, причем эти два последних порядка относятся к типу Proteobacteria (дополнительный файл 6).

После лечения Тиамулином™ класс Spirochaetes, к которому принадлежит B. pilosicoli , больше не обнаруживался с помощью подходов секвенирования 16S (рис. e). Тем не менее, этот класс бактерий снова появился через три недели после окончания лечения тиамулином™. Кроме того, в предыдущей публикации было показано, что при использовании более целенаправленных методов B. pilosicoli обнаруживались в каждой инфицированной группе на протяжении всего исследования [15]. Их относительный процент численности был выше, чем в обеих необработанных группах (до 25%), что, вероятно, связано с переходом бактерий в состояние покоя при лечении Тиамулином™ [16].

Используя MANOVA, мы заметили, что α-разнообразие в значительной степени связано с возрастом ( p -значение = 0,047) и лечением ( p -значение = 0,001), а также с взаимодействием между обоими факторами возраст*лечение (p-значение = 7,1*10 − 5 ). Как и ожидалось, дозировка антибиотика была связана с сильным снижением бактериального α-разнообразия по сравнению с контрольной и инфицированной группами на PM2 (значение p = 0,007 и 4,8*10 – 4 соответственно, рис. d). Однако к концу исследования α-разнообразие группы, получавшей лечение, было эквивалентно двум другим группам в тот же момент времени.Лечение тиамулином™ привело к значительному изменению β-разнообразия микробного сообщества слепой кишки (рис. b и дополнительный файл 5). Это было вызвано снижением относительной численности Firmicutes (с 30 до 22%) и увеличением доли Bacteroidetes (с 60 до 71%). Соотношение Firmicutes/Bacteroidetes было изменено приблизительно с 1:2 до 1:3. Хотя микробное разнообразие развивалось в течение трех недель после лечения Тиамулином™, оно не смогло вернуться к исходному составу к концу исследования и продолжало содержать относительно высокое относительное количество протеобактерий (рис.б и в).

Обсуждение

Несмотря на то, что было опубликовано несколько исследований [17–20], мало что известно о взаимосвязи между устойчивостью кишечной микробиоты при кишечных заболеваниях, ее восстановлением после лечения антибиотиками и общим влиянием на метаболизм хозяина. пробел в знаниях, который мотивировал это исследование. Желудочно-кишечные инфекции часто вызывают дисбактериоз микробиоты кишечника, как и лечение антибиотиками [21, 22]. Известно, что состав кишечной микробиоты играет важную роль в росте хозяина, а тяжелый дисбактериоз может быть причиной аномального развития [23, 24].Мы определили, что интервенционное исследование, направленное на оценку эффективности Тиамулина™ против АИС [15], позволит нам оценить, вызвано ли снижение скорости роста, связанное с инфекцией, дисбактериозом микробиоты слепой кишки. Мы предположили, что модификации кишечной микробиоты в результате инфекции приведут к модулированию метаболического гомеостаза хозяина, который был скорректирован в этом исследовании с помощью лечения тиамулином™. Материалы, используемые для этой статьи, были взяты из исследования, которое показало значительное снижение темпов роста среди других клинических последствий у кур-несушек в ответ на B.pilosicoli [15].

Инфекция привела к увеличению количества протеобактерий, многие из которых являются условно-патогенными микроорганизмами, связанными с повышенным риском диареи. Интересно, что обогащение Proteobacteria было связано с метаболическим синдромом [25]. Увеличение протеобактерий ранее наблюдалось в ответ на пенициллин у мышей, что было связано с увеличением массы тела, процента жировой массы и заболеваемостью диабетом [26].

В настоящем исследовании инфекция и бактериальный дисбиоз сопровождались глубокими системными метаболическими изменениями хозяина.Ряд пораженных инфекцией тканей (печень, селезенка, почки и плазма) свидетельствует о системной метаболической реакции организма на колонизацию и дисбактериоз. Интересно, что повышенные уровни глицерина были заметны во всех вышеупомянутых компартментах. Системное повышение уровня глицерина является маркером липолиза в жировых тканях, где триглицериды лизируются на свободные жирные кислоты и глицерин под действием ферментов липазы. Затем глицерин высвобождается в общий кровоток для использования в качестве предшественника глюкозы в печени и/или почках.Этот механизм обычно активируется длительным низким уровнем глюкозы в плазме. Кроме того, желудочно-кишечная инфекция может нарушать всасывание глюкозы из-за нарушения кишечного барьера, и, таким образом, возможно, что это явление также было вызвано снижением всасывания глюкозы в кишечнике. Известно, что B. pilosicoli сильно разрушает стенку кишечника [27], что также подтверждается наблюдением более высоких уровней глюкозы в фекалиях инфицированных птиц. Повышенное содержание полисахаридов в фекалиях также может быть связано со способностью B.pilosicoli для деградации муцина [28–30]. Кроме того, одновременное увеличение содержания бутирата и ацетата, наблюдаемое во время инфекции, свидетельствует о более высокой ферментации углеводов и, следовательно, об изменении метаболической активности ГМ. Концентрация глюкозы в плазме строго контролируется и регулируется, поскольку ее уровень необходимо поддерживать для поддержания основных функций, таких как мозговая и мышечная активность. Для поддержания уровня глюкозы глюконеогенез из глицерина активируется во время голодания, что требует накопления жира для высвобождения неэтерифицированных жирных кислот и глицерина в плазме.Это уменьшение жировой массы, вероятно, связано со снижением скорости роста, наблюдаемым у цыплят, колонизированных B. pilosicoli [15, 31]. Однако падение уровня глюкозы в плазме, наблюдаемое на PM2 после восстановления уровня глицерина, предполагает, что этот альтернативный метаболический путь не может поддерживать потребность в энергии в течение длительного времени.

Полное восстановление метаболического гомеостаза хозяина в ответ на инфекцию было достигнуто в конце исследования (PM3). Это совпало с чистым снижением процента инфицированных птиц во всех группах [15] и стабилизацией микробиоты слепой кишки.Следовательно, симптомы и заметные метаболические реакции хозяина на инфекцию возникали только при наличии дисбактериоза микробиоты. Такое наблюдение предполагает, что как присутствие патогена, так и модификация микробного сообщества кишечника необходимы для запуска метаболических реакций хозяина. Идея о том, что GM может действовать как буфер, регулирующий метаболический ответ хозяина на инфекцию патогеном, была частично исследована Khosravi et al. [32], которые показали, что инфекция Helicobacter pylori вызывала более сильный метаболический ответ хозяина (модификация уровней инсулина, грелина и лептина) у стерильных мышей, чем у обычных животных, и что вызванное инфекцией снижение скорости роста наблюдалось только в отсутствие ГМ.Эта толерантность к патогену была связана с тренировкой иммунной системы. Таким образом, инфекцию можно рассматривать как реакцию на изменение экосистемы, а не на колонизацию одним патогеном.

В этом наборе результатов Тиамулин™ был способен снижать индуцированный инфекцией метаболический ответ, повышать уровень бетаина и снижать уровень глюкозы в плазме. Хотя доза-эффект наблюдался на уровне инфекции, измеренном положительными мазками [15], это не было верно для уровней бетаина в плазме.Вероятно, повышение уровня бетаина в ответ на инфекцию связано с центральной осмопротекторной ролью этой молекулы [33]. Бетаин ранее использовался в качестве пищевой добавки для цыплят из-за его способности защищать кишечный барьер от патогенов, таких как Coccidia [34]. Действительно, инвазия клеток B. pilosicoli вызывает отек и нарушение осмотического баланса [9, 27]. Таким образом, повышенное количество бетаина (обычно поступающего из почек) может транспортироваться из других тканей к кишечному барьеру через общую циркуляцию, что объясняет его повышенный уровень в плазме.

Мы наблюдали, что нормальное «метаболическое старение» (снижение уровней ЛПВП/ЛПОНП и глюкозы в плазме), происходящее в период полового созревания, ускорялось при лечении тиамулином™. Интересно, что снижение соотношения ЛПВП/ЛПОНП и уровня глюкозы в общем кровотоке было связано с повышением уровня стероидных гормонов и, в частности, прогестерона [35–37]. Цитохром P450 3A (CYP3A, важное семейство ферментов, присутствующих в печени и участвующих в детоксикации лекарств) участвует в метаболизме стероидных гормонов (прогестерона, эстрогена и тестостерона).Кроме того, в нескольких исследованиях было показано, что снижение активности CYP3A обычно приводит к повышению концентрации стероидных гормонов в плазме [38–40]. Антибиотики — это активные молекулы, которые могут напрямую взаимодействовать с хозяином, если они способны преодолевать кишечный барьер. Сообщалось, что Тиамулин™ взаимодействует с CYP3A, образуя комплекс, который приводит к инактивации цитохрома in vitro и in vivo [41–44]. Таким образом, вполне вероятно, что наблюдаемый метаболический сдвиг в период до полового созревания является результатом взаимодействия Тиамулина™ с метаболизмом прогестерона.Это также подтверждается тем фактом, что начало яйцекладки, которое сильно зависит от созревания метаболизма стероидов, произошло раньше в двух группах, получавших самые высокие дозы Тиамулина™ [15]. В целом это подтверждает потенциальное взаимодействие Тиамулина™ с метаболизмом стероидов.

Наконец, сдвиг липопротеинов также может быть вызван модификациями микробиоты кишечника вследствие лечения антибиотиками. Метаболическое взаимодействие хозяин-ГМ широко исследовано. Действительно, во многих исследованиях сообщается, что ожирение и гомеостаз энергетического метаболизма тесно связаны с составом микробиоты кишечника [24, 45–47].Кроме того, было продемонстрировано, что использование антибиотиков до полового созревания у людей и мышей может быть связано с повышенным риском метаболических нарушений из-за модулирования микробиоты кишечника [26, 48, 49]. Интересно, что низкое соотношение Firmicutes/Bacteroidetes, как сообщается, связано с худощавым фенотипом и более низким риском развития нарушений, характеризующихся модификацией метаболизма холестерина [2, 50, 51]. Однако это противоречит нашим наблюдениям, которые предполагают, что обнаруженная модификация ЛПОНП/ЛПВП может быть вызвана самим тиамулином, а не модификациями микробиоты: является ли это общим явлением для некоторых или всех классов антибиотиков, несомненно, очень заслуживает будущего. изучать.Также мы должны помнить, что другие бактериальные изменения могут быть ответственны за модификацию метаболизма холестерина: действительно известно, что некоторые молочнокислые бактерии способны метаболизировать холестерин [52], и их использование в качестве кормовой добавки у цыплят-бройлеров приводило к снижению концентрации холестерина в плазме [52]. 53]. Следовательно, потребуются дальнейшие эксперименты, чтобы разделить эти аспекты.

Заключение

Эта работа демонстрирует, что состав микробиоты кишечника может быть связан с нарушениями системного метаболизма хозяина, которые приводят к фенотипическим изменениям.Мы наблюдали, что инфекция была связана с дисбактериозом, снижением усвоения питательных веществ и нарушением энергетического обмена хозяина, что приводило к значительному снижению скорости роста. Были идентифицированы два системных биомаркера инфекции: глицерин и бетаин. Повышение системного глицерина ясно иллюстрирует метаболическую адаптацию хозяина к кишечной инфекции, направленную на обеспечение достаточного количества энергии для выживания. Однако предположительно все же наблюдалось нарушение прибавки массы тела, поскольку глицерин, вероятно, поступал из жировой ткани.Кроме того, симптомы, связанные с колонизацией патогеном, наблюдались только в том случае, если они были связаны с микробным дисбиозом кишечника. Это открытие убедительно подтверждает потенциальную защитную роль микробиоты кишечника от условно-патогенных микроорганизмов. Это указывает на необходимость проведения дальнейших исследований для понимания экологического контекста, в котором патогенная бактерия может стать вредной для своего хозяина. В этом исследовании лечение антибиотиками уменьшало инфекцию и связанные с ней симптомы при одновременном изменении метаболизма холестерина.На основании наших результатов и ранее опубликованной работы мы выдвинули гипотезу о том, что метаболический ответ хозяина на лечение антибиотиками является результатом одновременной модификации состава кишечной микробиоты и метаболизма стероидов. Эти данные свидетельствуют о том, что влияние потребления антибиотиков на энергетический метаболизм хозяина следует изучать как ответ на прямое взаимодействие и через посредничество кишечной микробиоты. Наконец, антибиотик вызвал снижение α-разнообразия с последующим дисбактериозом, который может привести к большей уязвимости к колонизации патогеном и способствовать рецидиву.Следовательно, следует рассмотреть возможность лечения антибиотиками в сочетании с пищевыми добавками, такими как пре/про/симбиотики, для восстановления «более здоровой» кишечной микробиоты после вмешательства.

Методы

Изучение животных и план эксперимента

Кратко: 150 коммерческих кур-несушек NovoGen Brown в возрасте 16–17 недель, полученных от коммерческого поставщика (Tom Barron Ltd., Великобритания), содержали в APHA (Аддлстоун, Суррей, Великобритания). в соответствии с инструкциями Министерства внутренних дел (лицензия Министерства внутренних дел -PPL 70/7249-), и все процедуры проводились в соответствии с Законом о научных процедурах в отношении животных 1986 года.После исследования животных сжигали на месте, чтобы избежать риска заражения патогеном окружающей среды.

Экспериментальный план был описан ранее Woodward et al. [15] и для наглядности сведены на рис. Животных случайным образом распределяли по пяти группам ( n  = 30), получая следующие обработки: группа A: необработанные, неинфицированные контроли; Группа B: необработанные, инфицированные контроли; Группа C: инфицированные + тиамулин™ при 62,5 млн; Группа D: инфицированные + тиамулин™ при 125 мд; Группа E: инфицированные + тиамулин™ при 250 ppm.

После нейтрализации зоба птиц заражали через желудочный зонд 1 мл суспензии B. pilosicoli B2904 (5 × 10 9  КОЕ/мл) в течение пяти дней каждые два дня [54]. Через неделю после окончания заражения группы C, D и E получали различные концентрации тиамулина™ в питьевой воде в течение пяти дней. Затем птиц наблюдали в течение трех недель. Корм представлял собой нелекарственные гранулы несушек (Додсон и Хоррелл), а воду давали из водопровода, птицы имели доступ к обоим вволю.

Сбор образцов при исследовании на животных

Биопсии, образцы плазмы и фекалий были собраны во время патологоанатомического исследования в трех временных точках: на следующий день после окончания инфекционного процесса (PM1), на следующий день после окончания антибиотикотерапии лечения (РМ2) и в конце исследования (РМ3) (рис. а). Для каждой группы и момента времени случайным образом отбирали восемь птиц и проводили эвтаназию путем седативного действия с использованием смеси ромпун/кетамин в виде внутримышечной инъекции с последующей внутривенной инъекцией пентобарбитона.Кровь брали сначала из сердца, а сыворотку замораживали при - 80 °C после образования сгустка. Образцы биопсии ткани (приблизительно 1   г для всех тканей) и образцы фекалий, собранные непосредственно из кишечного тракта енота и слепой кишки (приблизительно 1   г), были быстро заморожены в жидком азоте, а затем сохранены при температуре - 80  °C для будущей оценки их метаболический состав и профиль микробиома слепой кишки.

Данные об общем влиянии инфекции и лечения Тиамулином™ на уровень инфекции, рост, состояние здоровья птиц (оценивается путем наблюдения за оперением птицы и развитием мускулатуры), яйценоскость, потребление воды и корма также приведены в вышеупомянутом статье [15] и здесь не повторяются.

Подготовка проб для ЯМР

Экстракцию полярных метаболитов почек, поджелудочной железы, селезенки и печени проводили путем гомогенизации 0,1 г ткани в 1 мл смеси 3:1 ( v /v) метанол/H 2 O с использованием раствора тканевый лизер [55]. После центрифугирования (10 мин при 12000×g) супернатанты высушивали в скоростном вакууме и ресуспендировали в 600 мкл фосфатного буфера (0,2М), содержащего 90% D 2 O и 10% H 2 O плюс 0,01%. 3-(триметилсилил)пропионат-2,3-d4 натрия (TSP используется в качестве внутреннего стандарта).Затем образцы (0,5 мл) переносили в 5 мм ЯМР-пробирки для сбора. Образцы плазмы смешивали с фосфатно-солевым буфером с 90% D2O в соотношении 2:1 (об./об.), затем 0,5 мл переносили в 5 мм пробирки для ЯМР. 0,0150 мкг биоптата печени добавляли с фосфатным буфером в центрифуге для твердотельной ЯМР-спектроскопии.

ЯМР-спектроскопия

Для тканей 1 Спектры Н-ЯМР были получены на спектрометре Bruker Advance 700 МГц с использованием стандартной импульсной программы noesypr1D с предварительным насыщением водой (задержка релаксации 2 с и время перемешивания 100 мс).Спектры 1D ЯМР плазмы были получены с использованием импульса Карра-Перселла-Мейбум-Гилла (CPMG). Биоптаты печени были получены на спектрометре Bruker Advance с частотой 500 МГц с использованием зонда 1 H HR MAS. Спектры были получены с использованием стандартного импульса noesypr1D, а также CPMG. Для всех матриц были проведены эксперименты 2D ЯМР на выбранных образцах, чтобы помочь идентифицировать метаболиты, а также ранее опубликованный атлас метаболизма цыплят [55]. Спектры были получены с использованием 256 сканирований с 16 фиктивными сканами (DS). Все спектры были записаны как 64 тыс. точек данных (15  м.д.).

Методы выделения ДНК для популяционных исследований на основе 16S

ДНК из образцов фекалий экстрагировали с использованием набора для выделения ДНК PowerSoil® ( MO BIO Laboratories, Inc) , приобретенного Qiagen. Для обеспечения качества образцов ДНК после экстракции была проведена ПЦР универсальной области V4-V5 16S рРНК (условия циклирования: 94°С в течение 3 мин; 30° циклов: 94°С в течение 30°с, 55°С в течение 45°с, 72°C в течение 1 мин, затем 72°C в течение 8 мин) и концентрацию оценивали с помощью капли Nano.Праймеры для ПЦР были следующими:

Секвенирование 16S следующего поколения

Аликвоты выделенной ДНК амплифицировали с универсальными праймерами для областей V4 и V5 гена 16S рРНК. Праймеры U515F (5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTA) и U927R (5′-CCCGYCAATTCMTTTTRAGT) были разработаны для обеспечения амплификации как бактериальных, так и архейных участков рибосомных генов [56]. Праймеры прямого слияния состояли из праймера A GS FLX Titanium и библиотечного ключа (5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG) вместе с одним из набора из восьми 10-основных мультиплексных идентификаторов (MID) (Roche Diagnostics Ltd., СОЕДИНЕННОЕ КОРОЛЕВСТВО). Праймеры для обратного слияния включали титановый праймер B GS FLX и библиотечный ключ (5’-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG). Амплификацию проводили с помощью полимеразы FastStart HiFi (Roche Diagnostics Ltd., Великобритания) при следующих условиях циклирования: 94°С в течение 3 мин; 25 циклов: 94 °C в течение 30 с, 55 °C в течение 45 с, 72 °C в течение 1 мин; затем 72 °C в течение 8 мин. Ампликоны очищали с использованием магнитных шариков Ampure XP (Beckman Coulter) и измеряли концентрацию каждого образца с использованием анализа Picogreen на основе флуоресценции (Invitrogen).Концентрации были нормализованы перед объединением образцов в партии до 16, каждая из которых впоследствии будет идентифицирована своим уникальным MID. Затем объединенные образцы подвергали однонаправленному секвенированию, начиная с прямого праймера, на платформе 454 GS FLX Titanium в соответствии с инструкциями производителя (Roche Diagnostics).

Конвейер Ampliconnoise [57] был использован для разделения набора данных на отдельные файлы для каждого образца в соответствии с используемыми адаптерами MID, а затем для удаления ошибок пиросеквенирования, ошибок ПЦР и химерных последовательностей.Для дальнейшего анализа оставляли только последовательности длиной более 400 оснований. Затем обработанные последовательности были классифицированы с использованием процесса выбора открытых эталонных OTU, реализованного в QIIME v1.9.1 (Caporaso, et al. 2010), по базе данных генов 16S рРНК Greengenes (http://greengenes.secondgenome.com/downloads/). Полученное распределение OTU по нескольким образцам было дополнительно проанализировано с использованием QIIME v1.9.1. обобщить распределения и исследовать альфа- и бета-разнообразие [58].

Статистический анализ

Для метабономического анализа после применения экспоненциального окна с расширением линии 0.3 Гц и преобразование Фурье, спектры индивидуально фазировали и корректировали по базовой линии в программе MestReNova (Mestrelab Research v.8.1.2). Затем спектры были импортированы в Matlab (Mathwork® v2013a), где они были откалиброваны по TSP (δ 0,00) для всех тканевых экстрактов, лактату (δ 1,33) для плазмы и протону H 1 α-глюкозы (δ 5,23) для биопсия печени. Спектры нормировались для каждой матрицы индивидуально с помощью метода вероятностных отношений [59]. Метаболические различия между образцами оценивали с помощью анализа основных компонентов (PCA).Этот шаг также использовался для удаления потенциальных выбросов, которые считались таковыми, если при регистрации не удалось получить спектр, сравнимый с другими образцами того же набора. Когда были выявлены интересующие групповые кластеры, ортогональная проекция на дискриминантный анализ латентной структуры (O-PLS DA) использовалась для оценки метаболических вариаций между группами с использованием спектров ЯМР в качестве матрицы независимых переменных и инфекции или лечения в качестве вектора прогнозирования. Алгоритм регрессионных моделей предоставлен компанией Korrigan Sciences Ltd.

Критерий Уилкоксона использовали для оценки значимости вариаций между группами в отношении массы тела и α-разнообразия с использованием R. Также был проведен тест MANOVA для определения влияния времени, инфекции и лечения на α-разнообразие на R (модель < − aov(α-разнообразие ~ время*инфекция*лечение). Наконец, из-за глубины секвенирования и метода мы решили провести анализ микробного сообщества на уровне семейства, а не на более низком таксономическом уровне. Статистический анализ проводился на нулевом завышенном логарифме преобразованное относительное изобилие.Всего было обнаружено 54 семейства, но только 40 присутствовали как минимум в 25% образцов. Бета-разнообразие на уровне семьи было выполнено путем расчета евклидова расстояния между особями.

Дополнительные файлы

Дополнительный файл 1: (14M, eps)

Инфекция изменяет метаболическую активность ГМ и содержание полисахаридов в просвете кишечника. (A) Баллы OPLS-DA по сравнению с перекрестно подтвержденными баллами, рассчитанными с использованием спектров фекальной воды групп A и B в PM2 и инфекции в качестве предиктора.(B) График загрузки, связанный с моделью OPLS-DA, описанной в A. (EPS 14763 kb)

Дополнительный файл 2: (615K, eps)

Уровень бетаина в плазме при PM2 для всех групп, A: контроль, B: Зараженные, C: инфицированные и пролеченные (62 ppm), D: инфицированные и пролеченные (125 ppm), E: инфицированные и пролеченные (250 ppm). * pv < 0,05; ** pv < 0,01. (EPS 614 kb)

Дополнительный файл 3: (601K, eps)

Уровень глюкозы в плазме при PM2 для всех групп, A: контроль, B: инфицированные, C: инфицированные и пролеченные (62 ppm), D: инфицированные и пролеченные (125 ppm), E: инфицированные и пролеченные (250 ppm).* pv < 0,05; ** pv < 0,01. (EPS 601 kb)

Дополнительный файл 4: (14M, eps)

Линейный ответ плазмы на лечебную дозу тиамулина. (A) График оценок в сравнении с перекрестно подтвержденными оценками регрессионной модели O-PLS, рассчитанными с использованием спектров H-ЯМР 1 птиц в PM2 в качестве матрицы независимых переменных и доз тиамулина в качестве предиктора. Параметры модели: R 2 Y = 0,48, Q 2 Y = 0,43 и p -значение = 0,01 (EPS 13970 кб)

Дополнительный файл 5 в процентах: (948K, eps05 относительное содержание) 900 OTU спирохет для каждой лечебной группы в ходе исследования.(EPS 948 kb)

Дополнительный файл 6: (2.0M, eps)

Нагрузки, связанные с графиком оценок PCA на рис., рассчитаны с использованием относительного количества OTU для всех образцов в качестве матрицы независимой переменной. А, нагрузки ПК1. B, Загрузка ПК2. (EPS 2121 КБ)

Дополнительный файл 8: (2.0K, csv)

Таблица S8 . Пример ключа и метаданных для дополнительного файла 7: таблица S7. (CSV 2 kb)

Благодарности

Авторы выражают благодарность Novartis за финансирование испытаний на животных.Мы также хотим поблагодарить сотрудников APHA и доктора Люка Дж. Мэппли за помощь в исследованиях in vivo, а также доктора Радослава Михала Ковальчика из Химико-аналитического центра (CAF) Университета Рединга за его помощь во время получения спектров 2D ЯМР. .

Финансирование

Мы признательны за поддержку компании Novartis, которая спонсировала исследование на животных, о котором сообщалось ранее [15], в рамках которого с разрешения были проведены эти дополнительные исследования.

Доступность данных и материалов

Данные о микробиоме, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью в Дополнительный файл 7: Таблица S7 [и Дополнительный файл 8 с образцом ключа для инфекции и лечения].Необработанные последовательности общедоступны в общедоступном хранилище EBI под регистрационным номером: PRJEB29134. Наборы метаболомных данных (спектры ЯМР), использованные и/или проанализированные в ходе текущего исследования, можно получить у соответствующего автора по обоснованному запросу.

Сокращения

ЛПВП липопротеинов высокой плотности
ЯМР Ядерный магнитный резонанс
О-PLS Д.А. Ортогональные проекции на латентные структуры дискриминантного анализа
РСА основного компонента Анализ
PM Post Mortl
VLDL
VLDL Очень низкая плотность Липопротеин

Взносы авторов

Исследование было разработано MJW, RMLR и SPC и образцами, собранными CLR.Получение ЯМР, статистика и анализ данных были проведены CLR, секвенирование следующего поколения и аннотация были выполнены RJE. Рукопись была составлена ​​CLR и проверена SPC, MJW, RMLR и RJE. Все авторы прочитали и одобрили рукопись.

Примечания

Утверждение этических норм и согласие на участие

Все процедуры проводились в соответствии с пересмотренным Законом о научных процедурах в отношении животных от 1986 г. в Великобритании и Директивой 2010/63ЕС в Европе, одобренной Агентством по охране здоровья животных и растений (APHA- https //www.gov.uk/government/organisations/animal-and-plant-health-agency/about/research#ethics-committee), а птиц содержали в соответствии с рекомендациями Министерства внутренних дел (лицензия Министерства внутренних дел -PPL 70/7249-). В этом исследовании использовались коммерческие куры-несушки NovoGen Brown, полученные от коммерческого поставщика (Tom Barron Ltd., Великобритания). Все эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями контрольного списка ПРИБЫТИЯ (Дополнительный файл 9).

Согласие на публикацию

Не применимо.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов в отношении этой работы.

Примечание издателя

Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

Ссылки

1. Хупер Л.В., Литтман Д.Р., Макферсон А.Дж. Взаимодействие микробиоты и иммунной системы. Наука. 2012;336(6086):1268–1273. doi: 10.1126/science.1223490. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]2. Лей Р.Е., Тернбо П.Дж., Кляйн С., Гордон Дж.И. Микробная экология: кишечные микробы человека, связанные с ожирением.Природа. 2006; 444:1022. doi: 10.1038/4441022a. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]3. Кани П.Д., Делзенн Н.М. Роль микробиоты кишечника в энергетическом обмене и метаболических заболеваниях. Курр Фарм Дез. 2009; 15:1546–1558. doi: 10.2174/138161209788168164. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]4. Клаус С.П., Эллеро С.Л., Бергер Б., Краузе Л., Бруттин А. и др. Индуцированное колонизацией микробное метаболическое взаимодействие между хозяином и кишечником. МБио. 2011;2:e00271–e00210. doi: 10.1128/mBio.00271-10. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]5.Спор А., Корен О., Лей Р. Раскрытие влияния окружающей среды и генотипа хозяина на микробиом кишечника. Nat Rev Microbiol. 2011;9:279. doi: 10.1038/nrmicro2540. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]6. Антарам В.К., Ли Э., Измаил А., Шарма А., Май В., Рэнд К.Х. и др. Дисбактериоз кишечника и истощение маслянообразующих бактерий при инфекции Clostridium difficile и нозокомиальной диарее. JCM. 2013;51(9):2884–2892. doi: 10.1128/JCM.00845-13. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]7.Schulfer AF, Battaglia T, Alvarez Y, Bijnens L, Ruiz VE, et al. Межпоколенческая передача нарушенной антибиотиками микробиоты усиливает колит у восприимчивых мышей. Нат микробиол. 2018;3:234. doi: 10.1038/s41564-017-0075-5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]8. Le Roy CI, Mappley LJ, La Ragione RM, Woodward MJ, Claus SP. Индуцированный Brachyspira pilosicoli кишечный спирохетоз птиц. Microb Ecol Health Дис. 2015;26:28853. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]9. Мэппли Л.Дж., Ла Раджоне Р.М., Вудворд М.Дж. Brachyspira и ее роль в кишечном спирохетозе птиц. Вет микробиол. 2014; 168: 245–260. doi: 10.1016/j.vetmic.2013.11.019. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 10. Дварс Р.М., Давелаар Ф.Г., Смит Х.Ф. Заражение родительских кур-бройлеров кишечными спирохетами птиц: влияние на яйценоскость и качество цыплят. Авиан Патол. 1993; 22: 693–701. doi: 10.1080/03079459308418957. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11. Поульсен С.М., Карлссон М., Йоханссон Л.Б., Вестер Б. Препараты плевромутилина тиамулин и валнемулин связываются с РНК в пептидилтрансферазном центре на рибосоме.Мол микробиол. 2001;41:1091–1099. doi: 10.1046/j.1365-2958.2001.02595.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 12. Pringle M, Landén A, Unnerstad HE, Molander B, Bengtsson B. Чувствительность к противомикробным препаратам свиней Brachyspira hyodysenteriae и Brachyspira pilosicoli , выделенных в Швеции в период с 1990 по 2010 год. Acta Vet Scand. 2012;54:54. дои: 10.1186/1751-0147-54-54. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]13. Стивенс CP, Хэмпсон DJ. Оценка тиамулина и линкомицина для лечения племенных бройлеров, экспериментально инфицированных кишечной спирохетой Brachyspira pilosicoli .Авиан Патол. 2002; 31: 299–304. doi: 10.1080/03079450220136501. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Burch DGS, Harding C, Alvarez R, Valks M. Лечение полевого случая кишечного спирохетоза птиц, вызванного Brachyspira pilosicoli , тиамулином. Авиан Патол. 2006; 35: 211–216. doi: 10.1080/03079450600711011. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Вудворд М.Дж., Мэппли Л., Ле Рой С., Клаус С.П., Дэвис П. и др. Применение Denagard® Tiamulin в питьевой воде для борьбы с инфекцией Brachyspira pilosicoli птицы-несушки.рез. вет. 2015;103:87–95. doi: 10.1016/j.rvsc.2015.09.015. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Le Roy CI, Passey JL, Woodward MJ, La Ragione RM, Claus SP. Метабономический анализ реакции Brachyspira pilosicoli на тиамулин показывает метаболическую активность, несмотря на значительное торможение роста. Анаэроб. 2017;45:71–77. doi: 10.1016/j.anaerobe.2017.03.018. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Lozupone CA, Stombaugh JI, Gordon JI, Jansson JK, Knight R. Разнообразие, стабильность и устойчивость микробиоты кишечника человека.Природа. 2012;489:220. doi: 10.1038/nature11550. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]18. Родригес Р.Р., Грир Р.Л., Донг Х, Д.Суза К.Н., Гурунг М. и др. Вызванные антибиотиками изменения микробиоты кишечника связаны с изменениями метаболизма глюкозы у здоровых мышей. Фронт микробиол. 2017;8:2306. doi: 10.3389/fmicb.2017.02306. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]19. Li J, Yang K, Ju T, Ho T, McKay CA, et al. Воздействие антибиотиков в раннем возрасте влияет на развитие островков поджелудочной железы и регуляцию метаболизма.Научный доклад 2017; 7: 41778. doi: 10.1038/srep41778. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]20. Детлефсен Л., Релман Д.А. Неполное восстановление и индивидуальная реакция микробиоты дистального отдела кишечника человека на повторное воздействие антибиотиков. ПНАС. 2001; 108 (Приложение 1): 4554–4561. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]21. Агилера М., Серда-Куэльяр М., Мартинес В. Дисбиоз, вызванный антибиотиками, изменяет взаимодействие хозяина и бактерий и приводит к сенсорным и моторным изменениям толстой кишки у мышей. Кишечные микробы.2015; 6:10–23. doi: 10.4161/194.2014.9

. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]22. Стечер Б., Майер Л., Хардт В.Д. «Цветение» в кишечнике: как дисбиоз может способствовать эволюции патогенов. Nat Rev Microbiol. 2013;11:277. doi: 10.1038/nrmicro2989. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Субраманиан С., Хук С., Яцуненко Т., Хак Р., Махфуз М. и др. Стойкая незрелость микробиоты кишечника у детей Бангладеш, страдающих от недоедания. Природа. 2014;510:417. doi: 10.1038/nature13421. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]24.Клаус СП. Борьба с недоеданием: не забывайте об ошибках. Клеточный микроб-хозяин. 2016;13:239–240. doi: 10.1016/j.chom.2013.02.015. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Тремароли В., Бекхед Ф. Функциональные взаимодействия между микробиотой кишечника и метаболизмом хозяина. Природа. 2012; 489:242. doi: 10.1038/nature11552. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 26. Кокс Л.М., Яманиши С., Сон Дж., Алексеенко А.В., Леунг Дж.М. и соавт. Изменение кишечной микробиоты во время критического окна развития имеет длительные метаболические последствия.Клетка. 2014; 158:705–721. doi: 10.1016/j.cell.2014.05.052. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]27. Мэппли Л.Дж., Чоржевска М.А., Кули В.А., Вудворд М.Дж., Ла Раджоне Р.М. Лактобациллы препятствуют росту, подвижности и прикреплению Brachyspira pilosicoli : потенциальное вмешательство против птичьего кишечного спирохетоза. АЕМ. 2011;77(15):5402–5411. doi: 10.1128/AEM.00185-11. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]28. Нареш Р., Хэмпсон DJ. Аттракцион Brachyspira pilosicoli к муцину.Микробиология. 2010; 156:191–197. doi: 10.1099/микрофон 0.030262-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Мэппли Л.Дж., Блэк М.Л., Абуун М., Дарби А.С., Вудворд М.Дж. и др. Сравнительная геномика штаммов Brachyspira pilosicoli : геномные перестройки, редукция и корреляция генетического комплемента с фенотипическим разнообразием. Геномика BMC. 2012;13:454. дои: 10.1186/1471-2164-13-454. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]31. Mappley LJ, Tchórzewska MA, Nunez A, Woodward MJ, Bramley PM, et al.Пероральное лечение цыплят Lactobacillus reuteri LM1 снижает патологию, индуцированную Brachyspira pilosicoli . ДжММ. 2013; 62: 287–296. [PubMed] [Google Scholar] 32. Хосрави Ю., Бунте Р.М., Чиоу К.Х., Тан Т.Л., Вонг В.Ю. и др. Helicobacter pylori и микробиота кишечника модулируют энергетический гомеостаз, прежде чем вызвать гистопатологические изменения у мышей. Кишечные микробы. 2016;7:48–53. doi: 10.1080/194.2015.1119990. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]33.Фелицкий Д.Дж., Кэннон Дж.Г., Капп М.В., Хонг Дж., Ван Винсберг А.В. и др. Исключение бетаина глицина с поверхности анионного биополимера: почему бетаин глицина является эффективным осмопротектором, но также и совместимым растворенным веществом. Биохимия. 2004;43:14732–14743. дои: 10.1021/bi049115w. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 34. Крейг С.А. Бетаин в питании человека. Am J Clin Nutr. 2004; 80: 539–549. doi: 10.1093/ajcn/80.3.539. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 35. Кушваха Р.С., Льюис Д.С., Кэри К.Д., JrHC MG. Влияние эстрогена и прогестерона на липопротеины плазмы и экспериментальный атеросклероз у павианов ( Papio sp. ) Тромб атеросклероза. 1991; 11: 23–31. doi: 10.1161/01.ATV.11.1.23. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 36. Судья С.М., Чаттертон РТ. Прогестерон-специфическая стимуляция биосинтеза триглицеридов в клеточной линии рака молочной железы (T-47D) Cancer Res. 1983; 43:4407–4412. [PubMed] [Google Scholar] 37. Сакс FM, Уолш Б.В. Влияние половых гормонов на липопротеины сыворотки крови: нерешенные вопросы биологии и клинической практики. Энн Н.Ю. Академия наук. 1990; 592: 272–285. doi: 10.1111/j.1749-6632.1990.tb30339.Икс. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 38. Нацухори М., ван Раак М., Лигтенберг М., Клей Л., тен Берге Д. и др. Выделение последовательности кДНК полноразмерного цитохрома P450 (CYP3A) крупного рогатого скота и ее функциональная экспрессия в клетках V79. Environ Toxicol Pharmacol. 1997; 3:17–24. doi: 10.1016/S1382-6689(96)00133-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 39. Бертилссон Г., Хайдрих Дж., Свенссон К., Осман М., Джендеберг Л. и др. Идентификация ядерного рецептора человека определяет новый сигнальный путь для индукции CYP3A.ПНАС. 1998;95:12208–12213. doi: 10.1073/pnas.95.21.12208. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]40. Лемли К.О., Батлер С.Т., Батлер В.Р., Уилсон М.Э. Инсулин изменяет катаболические ферменты прогестерона в печени цитохрома Р450 2С и 3А у молочных коров. JDS. 2008; 91: 641–645. [PubMed] [Google Scholar]41. Виткамп Р.Ф., Неймейер С.М., Ван Мирт А.С. Образование комплекса цитохрома Р-450 в печени крыс под действием антибиотика тиамулина. Противомикробные агенты Chemother. 1996;40:50–54. doi: 10.1128/AAC.40.1.50. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]42.Де Гроен Э.М., Неймейер С.М., Хорбах Г.Дж., Виткамп Р.Ф. Тиамулин ингибирует активность CYP3A4 человека в клеточной линии NIH/3T3, стабильно экспрессирующей кДНК CYP3A4. Биохим Фармакол. 1995; 50: 771–773. doi: 10.1016/0006-2952(95)00197-8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]43. Zweers-Zeilmaker WM, Van Miert AS, Horbach GJ, Witkamp RF. Комплексообразование in vitro и ингибирование активности цитохрома Р450 печени различными макролидами и тиамулином у коз и крупного рогатого скота. рез. вет. 1999; 66: 51–55. doi: 10.1053/rvsc.1998.0239. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]44. Ratz V, Laczay P, Mora ZS, Csiko GY, Monostori K, et al. Недавние исследования влияния тиамулина и монензина на активность цитохрома Р450 в печени у кур и индеек. J Vet Pharmacol Ther. 1997; 20: 415–418. doi: 10.1046/j.1365-2885.1997.00092.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]45. Муссо Г., Гамбино Р., Кассадер М. Взаимодействия между микробиотой кишечника и метаболизмом хозяина, предрасполагающие к ожирению и диабету. Анну Рев Мед. 2011;62:361–380. дои: 10.1146/аннурев-мед-012510-175505. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]46. Эверард А., полицейский Кани. Сахарный диабет, ожирение и микробиота кишечника. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2013; 27:73–83. doi: 10.1016/j.bpg.2013.03.007. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]47. Ларсен Н., Вогенсен Ф.К., ван ден Берг Ф.В., Нильсен Д.С., Андреасен А.С. и соавт. Микробиота кишечника у взрослых людей с диабетом 2 типа отличается от таковой у взрослых без диабета. ПЛОС Один. 2010;5:e9085. doi: 10.1371/journal.pone.0009085. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]48.Чо И., Яманиши С., Кокс Л., Мете Б.А., Завадил Дж. и др. Антибиотики в раннем возрасте изменяют микробиом толстой кишки мышей и ожирение. Природа. 2012; 488:621. doi: 10.1038/nature11400. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]49. Trasande L, Blustein J, Liu M, Corwin E, Cox LM, et al. Воздействие антибиотиков на младенцев и масса тела в раннем возрасте. Инт Дж. Обес. 2013;37:16. doi: 10.1038/ijo.2012.132. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]50. Ley RE, Bäckhed F, Turnbaugh P, Lozupone CA, Knight RD, et al.Ожирение изменяет микробную экологию кишечника. ПНАС. 2005; 102:11070–11075. doi: 10.1073/pnas.0504978102. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]51. Тернбо П.Дж., Лей Р.Е., Маховальд М.А., Магрини В., Мардис Э.Р. и др. Связанный с ожирением кишечный микробиом с повышенной способностью собирать энергию. Природа. 2006; 444:1027. doi: 10.1038/nature05414. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]52. Перейра Д.И., Гибсон Г.Р. Ассимиляция холестерина молочнокислыми бактериями и бифидобактериями, выделенными из кишечника человека.Appl Environ Microbiol. 2002; 68: 4689–4693. doi: 10.1128/AEM.68.9.4689-4693.2002. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]53. Джин Л.З., Хо Ю.В., Абдулла Н., Джалалудин С. Показатели роста, кишечные микробные популяции и уровень холестерина в сыворотке бройлеров, получавших рацион, содержащий культур Lactobacillus . Poult Sci. 1998; 77: 1259–1265. doi: 10.1093/ps/77.9.1259. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]54. Мэппли Л.Дж., Чоржевска М.А., Нуньес А., Вудворд М.Дж., Ла Рагионе Р.М. Доказательства системного распространения потенциально зоонозной кишечной спирохеты Brachyspira pilosicoli у экспериментально зараженных кур-несушек.J Med Microbiol. 2013; 62: 297–302. doi: 10.1099/jmm.0.052126-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]55. Le Roy CI, Mappley LJ, La Ragione RM, Woodward MJ, Claus SP. Метаболическая характеристика куриных тканей и биожидкостей на основе ЯМР: модель для исследования птиц. Метаболомика. 2016;12:157. doi: 10.1007/s11306-016-1105-7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]56. Эллис Р.Дж., Брюс К.Д., Дженкинс С., Стотард Дж.Р., Аджарова Л. и др. Сравнение микробиоты дистального отдела кишечника людей и животных в Африке.ПЛОС Один. 2013;8:e54783. doi: 10.1371/journal.pone.0054783. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]58. Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, Bittinger K, Bushman FD, et al. QIIME позволяет анализировать данные секвенирования с высокой пропускной способностью. Нат Методы. 2010;7:335. doi: 10.1038/nmeth.f.303. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]59. Гаваган С.Л., Уилсон И.Д., Николсон Дж.К. Физиологическая вариация в метаболическом фенотипировании и функциональных геномных исследованиях: использование коррекции ортогонального сигнала и PLS-DA.ФЭБС лат. 2002; 530:191–196. doi: 10.1016/S0014-5793(02)03476-2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Антибиотикотерапия туберкулеза вызывает глубокий дисбактериоз микробиома, который сохраняется долгое время после завершения терапии

Разрешение на исследование

Все добровольцы дали письменное информированное согласие на участие в этом исследовании. Все протоколы и формы согласия были одобрены экспертными советами GHESKIO и Weill Cornell Medicine. Все методы и процедуры выполнялись в соответствии с соответствующими институциональными руководствами и правилами.

Набор пациентов и защита субъектов-людей

Субъекты были зарегистрированы с помощью Tri-Intuitional Tuberculosis Research Unit (TBRU) совместно с центрами GHESKIO в Порт-о-Пренс, Гаити, где все участники предоставили письменное информированное согласие. Все протоколы TBRU и формы согласия для образцов, собранных в GHESKIO, были одобрены Институциональными наблюдательными советами GHESKIO и Weill Cornell Medicine (см. Одобрение исследования). Специализированная полевая клиническая группа в центрах GHESKIO в Порт-о-Пренс, Гаити, набрала добровольцев-исследователей в рамках финансируемого NIH U19 исследовательского подразделения по туберкулезу (AI111143).Инфекционный статус пациента Mtb определяется с помощью количественного анализа высвобождения IFNγ (IGRA), а активное заболевание ТБ определяется с использованием стандартных клинических оценок. Все пациенты с активным легочным ТБ проходят периодическое последующее наблюдение во время лечения, а любой, кто имел контакт с больным активным ТБ, проходит шестимесячное наблюдение и повторно проверяется на статус IGRA. Все образцы пациентов были деидентифицированы на месте с помощью системы штрих-кода, прежде чем они были отправлены в Нью-Йорк для анализа.ДНК человека была очищена от данных метагеномного секвенирования перед анализом и публикацией в соответствии с удалением всех биометрических идентификаторов в соответствии с Законом о переносимости и подотчетности медицинского страхования 30 . Все клинические метаданные собирались на месте и управлялись с помощью системы управления данными REDCap 31 .

Клинические характеристики исследовательских групп из исследования TBRU

Мы набрали четыре группы лиц, используя дизайн перекрестного исследования.Чтобы охарактеризовать кишечный микробиом людей из населения Гаити, мы набрали две группы контрольных людей: 50 без инфекции Mtb (IGRA-) и 25 латентно инфицированных Mtb (LTBI), что определялось положительным результатом теста на интерферон. Анализ гамма-выделения (IGRA). Чтобы определить влияние антимикобактериального лечения HRZE на кишечный микробиом, мы набрали 19 добровольцев, которые в настоящее время проходят лечение HRZE от лекарственно-чувствительного туберкулеза. 3 из этих пролеченных лиц находились на противотуберкулезной терапии дольше стандартных 6 месяцев по усмотрению врача (см. Таблицу 1).Кроме того, чтобы определить продолжительность нарушения микробиома при лечении HRZE, мы набрали 19 ранее леченных пациентов, которые были излечены от активного туберкулеза. Клинические характеристики групп приведены в таблице 1. Чтобы надлежащим образом контролировать возраст, мы разделили нашу группу ЛТБИ на две отдельные контрольные подгруппы, обозначенные как ЛТИ (контроль лечения) и ЛТБИ (контроль лечения), поскольку состав микробиома может значительно меняться с возрастом. 32 . Учитывая возрастной диапазон леченных и вылеченных пациентов, мы использовали контрольную группу в возрасте до 33 лет для контрольной группы лечения и контрольную группу в возрасте до 30 лет для вылеченной контрольной группы.Все субъекты ВИЧ-отрицательны. Однако другие клинические переменные, такие как история диабета, были недоступны.

Экстракция ДНК из кала

Образцы кала были собраны и хранились менее 24 часов при 4°C, разделены на аликвоты (~2 мл каждая), заморожены при -80°C и отправлены в Нью-Йорк. ≈500 мг стула из замороженных образцов суспендировали в 500 мкл экстракционного буфера (200 мМ Tris-HCl, pH = 8,0; 200 мМ NaCl; 20 мМ ЭДТА), 210 мкл 20% SDS, 500 мкл фенола/хлороформа/ изоамилового спирта (25:24:1) и 500 мкл 0.Шарики циркония/диоксида кремния диаметром 1 мм (продукты BioSpec). Образцы лизировали посредством механического разрушения бисерной мешалкой (BioSpec Products) в течение двух минут с последующими двумя экстракциями смесью фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1). ДНК осаждали этанолом и ацетатом натрия при -80 °C в течение 1 часа, повторно суспендировали в 200 мкл воды, не содержащей нуклеаз, и дополнительно очищали с помощью набора QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) в соответствии с протоколами производителя, включая удаление белка. обработкой протеиназой К.ДНК элюировали 200 мкл воды без нуклеаз и сортировали при -20°С.

16S секвенирование рДНК

Для амплификации рДНК использовали следующие праймеры: 563 F (59-nnnnnnnn-NNNNNNNNNNNN-AYTGGGYDTAAAGN G-39) и 926 R (59-nnnnnnnn-NNNNNNNNNNNN-CCGTCAATTYH9TTTR AGT-39). Каждая реакция содержала 50 нг очищенной ДНК, 0,2 мМ dNTP, 1,5 мкМ MgCl 2 , 1,25 ед. Platinum TaqDNA полимеразы, 2,5 мкл 10 х ПЦР-буфера и 0,2 мкМ каждого праймера. Уникальный штрих-код Голея из 12 оснований (Ns) предшествовал праймерам для идентификации образцов после объединения ампликонов.Перед штрих-кодом добавляли от одного до восьми дополнительных нуклеотидов, чтобы компенсировать секвенирование праймеров. Условия циклирования были следующими: 94 °C в течение 3 мин, затем 27 циклов 94°C в течение 50 с, 51°C в течение 30 с и 72°C в течение 1 мин, где финальная стадия удлинения проводилась при 72°C. в течение 5 мин. Репликаты ПЦР объединяли и затем очищали с использованием набора для очистки ПЦР Qiaquick (Qiagen) и набора для очистки ПЦР Qiagen MinElute. Продукты ПЦР определяли количественно и объединяли в эквимолярных количествах перед лигированием штрих-кодов и адаптеров Illumina с использованием процедуры подготовки образцов Illumina TruSeq.Готовая библиотека была секвенирована на платформе Illumina Miseq в соответствии с протоколом, рекомендованным Illumina.

Биоинформатический анализ 16S

Для секвенирования 16S MiSeq считывания парных концов объединяли, демультиплексировали, фильтровали по качеству с использованием максимальной ожидаемой ошибки (Emax = 1) и дереплицировали. Последовательности были сгруппированы в операционные таксономические единицы (OTU) с 97% сходством на основе расстояния с использованием UPARSE 33 . Потенциально химерные последовательности были удалены как de novo, так и эталонными методами (где для последнего использовалась база данных Gold) 34 .Таксономические присвоения были сделаны с использованием BLASTN 35 по базе данных NCBI refseq_rna с пользовательскими скриптами 36 . Наш подход позволяет идентифицировать 30 основных таксонов, связанных с конкретной OTU, поэтому таксономическая номенклатура, которую мы используем для 16S, является универсальной. Эти данные о вызовах OTU доступны в дополнительных таблицах 2 и 3: в дополнительной таблице 2 приведены результаты OTU BLASTN для LTBI (контроль лечения) и когорты лечения, а в дополнительной таблице 3 приведены результаты OTU BLASTN для LTBI (вылеченный контроль) и вылеченные когорты.Файл матрицы биологических наблюдений (biom) 37 , файл таксономии, файл эталонной последовательности и файл дерева были созданы с использованием команд QIIME. Эти файлы были импортированы в R 38 и объединены с файлом метаданных в один объект Phyloseq 39 . Phyloseq использовался для всего последующего анализа таксономических данных 16S, а графики были построены с помощью пакета ggplot2 40 .

Метагеномное секвенирование методом дробовика

От 150 до 200 нг ДНК, выделенной из стула (см. выше), подвергали акустическому сдвигу.Библиотеки для секвенирования Hiseq готовили с использованием набора KAPA Hyper Prep Kit (Roche). ПЦР-амплификацию библиотек проводили в течение 6 циклов. Образцы анализировали на Hiseq 4000 в парном конце 125 bp/125 bp с использованием набора TruSeq SBS Kit v3 (Illumina). Среднее количество пар чтения на образец составляло около 11 миллионов.

Биоинформатический анализ Shotgun

Для анализа метагеномных ридов Shotgun последовательности были сначала обрезаны и удалены от хозяина с использованием Trimmomatic 41 и Bowtie2 42 .Затем деконтаминированные хозяином чтения были профилированы по обилию микробных видов с использованием Metaphlan2 43 , а также по обилию гена Uniref и ортологов KEGG, а также по функциональным путям (путям Metacyc, путям KEGG и модулям KEGG) с использованием конвейера программного обеспечения HUMAnN2 22 и внутренние письменные сценарии (предоставляются по запросу). Затем нормализованные таксономические, генные и метаболические пути использовались для последующего статистического анализа в R. Все образцы кишечного микробиома были секвенированы с использованием секвенирования 16S рДНК, однако только подмножество контролей было секвенировано с использованием метагеномики.Из-за ограничений размера выборки для сравнения секвенирования метагеномной ДНК мы объединили как Mtb неинфицированных, так и лиц с ЛТБИ в здоровую контрольную группу, которая использовалась в качестве компаратора для метагеномного анализа.

Статистический анализ

Способность обнаруживать дифференциально распространенные OTU между группами людей имеет решающее значение для сравнения между группами, и существуют различные методы, которые были проверены для такого рода анализа. Для секвенирования 16S рДНК мы использовали инструменты, доступные в пакете Phyloseq, для обработки данных и метаданных для последующего анализа.Необработанные подсчеты с таксономией и метаданными были переданы в пакет DESeq2 для дифференциального анализа численности с использованием предположения об отрицательном биномиальном распределении с нулевой инфляцией 19 . Этот метод предполагает, что для многих OTU дисперсия численности (т. е. количества прочтений) между образцами или группами превышает среднее количество прочтений (часто равно нулю). Когда это так, метод DESeq можно использовать для преобразования данных, чтобы можно было более точно сравнивать различия между выборками или между группами.Гомоскедастические данные об изобилии использовались для создания тепловых карт на рис. 3c и d путем применения преобразования, стабилизирующего дисперсию, из подобранных средних дисперсии для преобразования данных подсчета. Мы дополнительно использовали удобный для микробиома линейный дискриминантный анализ, инструмент размера эффекта (LEfSe) 20 для выявления статистически значимых различий между клиническими группами. В этом методе сначала используется непараметрический критерий сумм-рангов Крускала-Уоллиса (КВ) между различными группами людей (т., здоровые [состоит из Mtb неинфицированных и ЛТБИ], получающих лечение HRZE или вылеченных), с последующим линейным дискриминантным анализом для оценки размера эффекта (т. , или путь между группами). Мы попытались использовать как методы DESeq2, так и LEfSe, и попытались подчеркнуть, где есть совпадение. Все рисунки в статье, относящиеся к анализу последовательности 16S, построены с использованием нормализованного и преобразованного содержания из пакета DESeq2.Для статистического анализа результатов чтения метагеномики дробовика данные были импортированы в R и преобразованы в объекты Phyloseq с помощью пользовательских сценариев. Пользовательский код, реализующий непараметрические тесты (ранг со знаком Уилкоксона) с коррекцией FDR (метод Бенджамини и Хохберга), а также LEfSe 20 , использовался для проверки дифференциальной численности таксонов и функциональных путей. Для сравнений LTBI-Treatment и LTBI-Cured пороговое значение p-значения сохранялось на уровне 0,05 как для исходного критерия Краскела-Уоллиса, так и для последующих ранговых тестов Уилкоксона для соответствующих по полу подклассов.Мы дополнительно использовали тесты Permanova и Betadisper с использованием функции adonis в пакете Vegan в R. Adonis разбивает матрицу расстояний данных подсчета OTU и проводит анализ дисперсии между группами выборок. Betadisper также поддерживает этот вывод, определяя, одинаково ли распределяется дисперсия между двумя группами. Все графики типа «ящик с усами» были сгенерированы с помощью функции ggplot2 40 geom_boxplot, которая показывает первый и третий квартили набора данных и медиану данных в поле, «усы» показывают 1.5-кратное значение межквартильного диапазона шарнира коробки, а выбросы показаны точками. Все остальные графики были сделаны с помощью Prism 7.

Доступность данных

Все данные секвенирования и компьютерный код, а также метаданные, подтверждающие результаты этого исследования, можно получить у соответствующих авторов по запросу.

Антибиотикоассоциированный дисбактериоз влияет на способность кишечной микробиоты контролировать воспаление кишечника при трансплантации фекальной микробиоты в экспериментальных моделях колита | Микробиом

  • Камада Н., Сео С.У., Чен Г.Ю., Нуньес Г.Роль микробиоты кишечника в иммунитете и воспалительных заболеваниях. Нат Рев Иммунол. 2013;13(5):321–35.

    КАС пабмед Статья ПабМед Центральный Google ученый

  • Моди С.Р., Коллинз Дж.Дж., Релман Д.А. Антибиотики и микробиота кишечника. Джей Клин Инвест. 2014;124(10):4212–8.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Баумлер А.Дж., Сперандио В.Взаимодействия между микробиотой и патогенными бактериями в кишечнике. Природа. 2016;535(7610):85–93.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Ракофф-Нахум С., Паглино Дж., Эслами-Варзанех Ф., Эдберг С., Меджитов Р. Распознавание комменсальной микрофлоры толл-подобными рецепторами необходимо для гомеостаза кишечника. Клетка. 2004;118(2):229–41.

    КАС пабмед Статья ПабМед Центральный Google ученый

  • Скотт Н.А., Андрусайте А., Андерсен П., Лоусон М., Алкон-Гинер С., Леклер С., Кэйм С., Ле Галл Г., Шоу Т., Коннолли Дж. П. Р. и др.Антибиотики вызывают устойчивую дисрегуляцию Т-клеточного иммунитета кишечника, нарушая гомеостаз макрофагов. Sci Transl Med. 2018;10(464):eaao4755.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

  • Burrello C, Garavaglia F, Cribiu FM, Ercoli G, Bosari S, Caprioli F, Facciotti F. Краткосрочное пероральное лечение антибиотиками способствует воспалительной активации инвариантных Т-киллеров и обычных CD4(+) Т-клеток.Front Med (Лозанна). 2018;5:21.

    Артикул Google ученый

  • Кронман М.П., ​​Заутис Т.Е., Хейнс К., Фэн Р., Коффин С.Е. Воздействие антибиотиков и развитие ВЗК у детей: популяционное когортное исследование. Педиатрия. 2012;130(4):e794–803.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Шоу С.Ю., Бланшар Дж.Ф., Бернстайн К.Н. Связь между применением антибиотиков на первом году жизни и воспалительными заболеваниями кишечника у детей.Am J Гастроэнтерол. 2010;105(12):2687–92.

    ПабМед Статья Google ученый

  • Убеда С., Таур Ю., Дженк Р.Р., Эквинда М.Дж., Сон Т., Самстейн М., Виале А., Соччи Н.Д., ван ден Бринк М.Р., Камбой М. и др. Доминирование устойчивых к ванкомицину энтерококков в кишечной микробиоте обеспечивается лечением антибиотиками у мышей и предшествует инвазии в кровоток у людей. Джей Клин Инвест. 2010;120(12):4332–41.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Льюис Б.Б., Баффи К.Г., Картер Р.А., Лейнер И., Туссен Н.К., Миллер Л.С., Гобурн А., Линг Л., Памер Э.Г.Потеря опосредованной микробиотой резистентности к инфекции Clostridium difficile при пероральном приеме ванкомицина по сравнению с метронидазолом. J заразить дис. 2015;212(10):1656–65.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Glick LR, Sossenheimer PH, Ollech JE, Cohen RD, Hyman NH, Hurst RD, Rubin DT. Низкие дозы метронидазола связаны со снижением частоты эндоскопических рецидивов болезни Крона после резекции подвздошной кишки: ретроспективное когортное исследование.Дж. Колит Крона. 2019;13(9):1158–62.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Буррелло С., Джуффре М.Р., Макандог А.Д., Диас-Басабе А., Крибиу Ф.М., Лопес Г., Борго Ф., Нези Л., Каприоли Ф., Векки М. и др. Трансплантация фекальной микробиоты контролирует хроническое воспаление кишечника у мышей, модулируя функции иммунных клеток и состав кишечной микробиоты. Клетки. 2019;8(6):517.

    КАС ПабМед Центральный Статья пабмед Google ученый

  • Буррелло С., Гаравалья Ф., Крибиу Ф.М., Эрколи Г., Лопес Г., Троизи Дж., Колуччи А., Гульетта С., Карлони С., Гульельметти С. и др.Терапевтическая трансплантация фекальной микробиоты контролирует воспаление кишечника посредством секреции IL-10 иммунными клетками. Нац коммун. 2018;9(1):5184.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

  • Albanese D, Fontana P, De Filippo C, Cavalieri D, Donati C. MICCA: полное и точное программное обеспечение для таксономического профилирования метагеномных данных. Научн. отп. 2015; 5:9743.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Ван К., Гэррити Г.М., Тидже Д.М., Коул М.Р.Наивный байесовский классификатор для быстрого отнесения последовательностей рРНК к новой таксономии бактерий. Appl Environ Microbiol. 2007;73(16):5261–7.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • ДеСантис Т., Хугенхольц П., Келлер К., Броди Э., Ларсен Н., Пичено Й., Фан Р., Андерсен Г.Л. NAST: сервер множественного выравнивания последовательностей для сравнительного анализа генов 16S рРНК. Нуклеиновые Кислоты Res. 2006; 34 (дополнение 2): W394–9.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • ДеСантис Т.З., Хугенгольц П., Ларсен Н., Рохас М., Броди Э.Л., Келлер К., Хубер Т., Далеви Д., Ху П., Андерсен Г.Л. Greengenes, проверенная химера база данных генов 16S рРНК и рабочая среда, совместимая с ARB. Appl Environ Microbiol. 2006;72(7):5069–72.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Цена МН, Дехал П.С., Аркин А.П.FastTree 2 — приблизительно деревья максимального правдоподобия для больших выравниваний. ПЛОС Один. 2010;5(3):e9490.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

  • McMurdie PJ, Holmes S. Phyloseq: пакет R для воспроизводимого интерактивного анализа и графики данных переписи микробиома. ПЛОС Один. 2013;8(4):e61217.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Сегата Н., Изард Дж., Уолдрон Л., Геверс Д., Миропольски Л., Гарретт В.С., Хаттенхауэр К.Открытие и объяснение метагеномных биомаркеров. Геном биол. 2011;12(6):R60.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Брейман Л. Случайные леса. Машинное обучение. 2001;45(1):5–32.

    Артикул Google ученый

  • Мерфи М.А., Эванс Дж.С., Сторфер А. Количественная оценка связи Bufo Borea в Йеллоустонском национальном парке с генетикой ландшафта.Экология. 2010;91(1):252–61.

    ПабМед Статья Google ученый

  • Roggero P, Liotto N, Pozzi C, Braga D, Troisi J, Menis C, Gianni ML, Berni Canani R, Paparo L, Nocerino R, et al. Анализ созревания иммунитета, микробиоты и метаболома у младенцев в клинических испытаниях смеси, ферментированной Lactobacillus paracasei CBA L74. Нац коммун. 2020;11(1):2703.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Sumner LW, Amberg A, Barrett D, Beale MH, Beger R, Daykin CA, Fan TW, Fiehn O, Goodacre R, Griffin JL, et al.Предлагаемые минимальные стандарты отчетности для химического анализа Рабочая группа по химическому анализу (CAWG) Инициатива по стандартам метаболомики (MSI). Метаболомика. 2007;3(3):211–21.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Wold S, Sjöström M, Eriksson L. PLS-регрессия: основной инструмент хемометрики. Методы ПЛС. 2001; 58: 109–30.

    КАС Google ученый

  • Сыси-Ахо М., Катаямаа М., Йетукури Л., Оресич М.Метод нормализации данных метаболомики с использованием оптимального выбора нескольких внутренних стандартов. Биоинформатика BMC. 2007; 8:93.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

  • Caprioli F, Pallone F, Monteleone G. Иммунный ответ Th27 при ВЗК: новый патогенный механизм. Дж. Колит Крона. 2008;2(4):291–5.

    ПабМед Статья Google ученый

  • Burrello C, Pellegrino G, Giuffre MR, Lovati G, Magagna I, Bertocchi A, Cribiu FM, Boggio F, Botti F, Trombetta E, et al.Связанная со слизистой оболочкой микробиота управляет патогенными функциями кишечных iNKT-клеток, происходящих из ВЗК. Альянс наук о жизни. 2019;2(1):e201800229.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Мариотти С., Нисини Р.: Создание клонов Т-клеток человека. В: Протоколы Т-клеток. изд.: Springer; 2009: 65-93.

  • Team RC: язык и среда для статистических вычислений. R Фонд статистических вычислений, 2015; Вена, Австрия.В.; 2016.

  • Бенджамини Ю., Хохберг Ю. Контроль частоты ложных открытий: практичный и мощный подход к множественному тестированию. JR Stat Soc B Methodol. 1995: 289–300.

  • Revelle W. Психология: процедуры психологических, психометрических и личностных исследований. Пакет R версии 1.3. 10. Эванстон: Северо-западный университет; 2013.

    Google ученый

  • Kump P, Wurm P, Grochenig HP, Wenzl H, Petritsch W, Halwachs B, Wagner M, Stadlbauer V, Eherer A, Hoffmann KM, et al.Таксономический состав кишечной микробиоты донора является основным фактором, влияющим на эффективность трансплантации фекальной микробиоты при рефрактерном к терапии язвенном колите. Алимент Фармакол Тер. 2018;47(1):67–77.

    КАС пабмед Статья ПабМед Центральный Google ученый

  • Иванов И.И., Атараши К., Манел Н., Броди Э.Л., Шима Т., Караоз У., Вей Д., Гольдфарб К.С., Санти К.А., Линч С.В. Индукция кишечных клеток Th27 сегментированными нитчатыми бактериями.Клетка. 2009;139(3):485–98.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • An D, Oh SF, Olszak T, Neves JF, Avci FY, Erturk-Hasdemir D, Lu X, Zeissig S, Blumberg RS, Kasper DL. Сфинголипиды симбиотического микроба регулируют гомеостаз Т-клеток естественных киллеров кишечника хозяина. Клетка. 2014;156(1-2):123–33.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Проект микробиома человека C.Структура, функции и разнообразие микробиома здорового человека. Природа. 2012;486(7402):207–14.

    Артикул КАС Google ученый

  • Ирразабаль Т., Тхакур Б.К., Канг М., Малайз И., Штройкер С., Вонг Э.О., Коупленд Дж., Грайф Р., Гуттман Д.С., Наварра В.В. и др. Ограничение окислительного повреждения ДНК снижает колоректальный рак, связанный с микробным колитом. Нац коммун. 2020;11(1):1802.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Белчева А., Ирразабал Т., Робертсон С.Дж., Стройткер С., Моган Х., Рубино С., Морияма Э.Х., Коупленд Дж.К., Сурендра А., Кумар С. и др.Метаболизм микробов кишечника стимулирует трансформацию MSh3-дефицитных эпителиальных клеток толстой кишки. Клетка. 2014;158(2):288–99.

    КАС пабмед Статья ПабМед Центральный Google ученый

  • Кумар А., Ву Х., Кольер-Хьямс Л.С., Квон Ю.М., Хэнсон Дж.М., Нейш А.С. Продукт бактериальной ферментации бутират влияет на эпителиальную передачу сигналов посредством опосредованных активными формами кислорода изменений в неддиляции куллина-1. Дж Иммунол. 2009;182(1):538–46.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Смит П.М., Ховитт М.Р., Паников Н., Мишо М., Галлини К.А., Бохлули Ю.М., Гликман Д.Н., Гарретт В.С. Микробные метаболиты, жирные кислоты с короткой цепью, регулируют гомеостаз Treg-клеток толстой кишки. Наука. 2013;341(6145):569–73.

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Фурусава Ю., Обата Ю., Фукуда С., Эндо Т.А., Накато Г., Такахаши Д., Наканиши Ю., Уэтаке С., Като К., Като Т. и др.Бутират комменсального микробного происхождения индуцирует дифференцировку регуляторных Т-клеток толстой кишки. Природа. 2013; 504(7480):446–50.

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Аморозо С., Перилло Ф., Страти Ф., Фантини М., Каприоли Ф., Фаччиотти Ф. Роль биомодуляторов кишечной микробиоты в иммунитете слизистой оболочки и воспалении кишечника. Клетки. 2020;9(5):1234.

    КАС ПабМед Центральный Статья пабмед Google ученый

  • Перилло Ф., Аморозо С., Страти Ф., Джуффре М.Р., Диас-Басабе А., Латтанзи Г., Фаччиотти Ф.Манипуляции с микробиотой кишечника как инструмент лечения колоректального рака: последние достижения в его использовании в терапевтических целях. Int J Mol Sci. 2020;21(15):5389.

    КАС ПабМед Центральный Статья пабмед Google ученый

  • Гао X, Цао Цюй, Ченг И, Чжао Д, Ван Зи, Ян Х, Ву Цюй, Ю Л, Ван И, Линь И и др. Хронический стресс способствует развитию колита, нарушая микробиоту кишечника и вызывая реакцию иммунной системы. Proc Natl Acad Sci U S A.2018;115(13):E2960–9.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Ллойд-Прайс Дж., Арзе С., Анантакришнан А.Н., Ширмер М., Авила-Пачеко Дж., Пун Т.В., Эндрюс Э., Аджами Н.Дж., Бонэм К.С., Бриславн С.Дж. и др. Мультиомика кишечной микробной экосистемы при воспалительных заболеваниях кишечника. Природа. 2019; 569(7758):655–62.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Саррабейроуз Г., Ландольфи С., Посуэло М., Уилламил Дж., Варела Э., Кларк А., Кампос Д., Эррера С., Сантьяго А., Махиелс К. и др.Микробная нагрузка на слизистую оболочку при болезни Крона: потенциальный предиктор ответа на трансплантацию фекальной микробиоты. ЭБиоМедицина. 2020;51:102611.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Белзер К., де Вос В.М. Микробы внутри — от разнообразия к функциям: случай Akkermansia. ISME J. 2012;6(8):1449–58.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Ventura M, Turroni F, Motherway MOC, MacSharry J, van Sinderen D.Взаимодействия хозяин-микроб, которые способствуют колонизации кишечника комменсальными бифидобактериями. Тенденции микробиол. 2012;20(10):467–76.

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Theriot CM, Koenigsknecht MJ, Carlson PE Jr, Hatton GE, Nelson AM, Li B, Huffnagle GB, ZL J, Young VB. Индуцированные антибиотиками сдвиги в микробиоме и метаболоме кишечника мыши повышают восприимчивость к инфекции Clostridium difficile. Нац коммун. 2014;5:3114.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

  • Мацубара Т., Танака Н., Краус К.В., Манна С.К., Канг Д.В., Андерсон Э.Р., Люке Х., Паттерсон А.Д., Шах Ю.М., Гонсалес Ф.Дж. Метаболомика идентифицирует воспалительный каскад, вовлеченный в стеатогепатит, вызванный диоксином и диетой. Клеточный метаб. 2012;16(5):634–44.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Fais S, Pallone F, Squarcia O, Biancone L, Ricci F, Paoluzi P, Boirivant M: Антигены HLA-DR на эпителиальных клетках толстой кишки при воспалительном заболевании кишечника: I.Отношение к состоянию активации лимфоцитов собственной пластинки и эпителиальной экспрессии других поверхностных маркеров. Clin Exp Immunol 1987, 68(3):605.

  • Фурнье Б., Паркос С. Роль нейтрофилов при воспалении кишечника. Иммунол слизистых оболочек. 2012;5(4):354–66.

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Hill C, Guarner F, Reid G, Gibson GR, Merenstein DJ, Pot B, Morelli L, Canani RB, Flint HJ, Salminen S.Консенсусное заявление Международной научной ассоциации пробиотиков и пребиотиков в отношении объема и надлежащего использования термина пробиотик. Нат Рев Гастроэнтерол Гепатол. 2014;11(8):506–14.

    ПабМед Статья Google ученый

  • Marco ML, Heeney D, Binda S, Cifelli CJ, Cotter PD, Foligné B, Gänzle M, Kort R, Pasin G, Pihlanto A. Польза ферментированных продуктов для здоровья: микробиота и не только. Курр Опин Биотехнолог. 2017; 44:94–102.

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • van Zanten GC, Krych L, Roytio H, Forssten S, Lahtinen SJ, Abu Al-Soud W, Sorensen S, Svensson B, Jespersen L, Jakobsen M. Синбиотик Lactobacillus acidophilus NCFM и целлобиоза не влияют на бактерии кишечника человека разнообразие, но увеличивает количество лактобацилл, бифидобактерий и жирных кислот с разветвленной цепью: рандомизированное двойное слепое перекрестное исследование. FEMS Microbiol Ecol.2014;90(1):225–36.

    ПабМед Статья КАС Google ученый

  • Welcker K, Martin A, Kolle P, Siebeck M, Gross M. Повышенная проницаемость кишечника у пациентов с воспалительным заболеванием кишечника. Евр J Med Res. 2004;9(10):456–60.

    КАС пабмед Google ученый

  • Di Giacinto C, Marinaro M, Sanchez M, Strober W, Boirivant M. Пробиотики облегчают рецидивирующий Th2-опосредованный колит у мышей, индуцируя IL-10 и IL-10-зависимые регуляторные клетки, несущие TGF-β.Дж Иммунол. 2005;174(6):3237–46.

    ПабМед Статья Google ученый

  • Восстановление кишечных микробов, отсутствующих при дисбактериозе в раннем возрасте, может снизить риск колита у генетически предрасположенных мышей

    Новое исследование Чикагского университета установило, что восстановление одного микробного вида — Bacteroides sp. CL1-UC (Bc) — к кишечному микробиому в ключевой момент развития может предотвратить колит, вызванный антибиотиками, в мышиной модели этого состояния.Результаты, опубликованные 7 июня в журнале Gastroenterology , имеют серьезные последствия для людей, страдающих воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК), и подчеркивают влияние воздействия в раннем детстве на здоровье на протяжении всей жизни.

    Предыдущие исследования на людях показали, что воздействие антибиотиков в раннем возрасте может искажать микробиом кишечника, вызывая дисбактериоз или дисбаланс микробных популяций в кишечнике, что коррелирует с повышенным риском развития ВЗК у детей.

    «Мы знаем, что виды микробов, которым вы подвергаетесь в раннем возрасте, на самом деле определяют, как развивается ваша иммунная система», — сказал старший автор Юджин Чанг, доктор медицинских наук, профессор медицины Мартина Бойера в Калифорнийском университете в Чикаго. «Наша иммунная система учится распознавать себя и триллионы микробов в нашем кишечнике — они тоже «мы», поэтому наша иммунная система должна научиться терпеть эти организмы так же, как она терпима к нашим собственным клеткам. Раннее воздействие антибиотиков может уничтожить некоторые организмы, которые необходимы для обучения иммунной системы развитию иммунной толерантности.

    Из-за сложностей проведения таких исследований на людях исследователи решили использовать обычную модель для изучения колита: мыши, у которых отсутствует ген, известный как IL-10 (IL-10 -/- ). «Было установлено, что эта модель мыши генетически восприимчива к ВЗК, и мы знаем, что микробиом кишечника играет решающую роль в развитии колита в этой модели», — сказал первый автор Дзюн Миёси, доктор медицинских наук, старший доцент в кафедрой гастроэнтерологии и гепатологии в Медицинской школе Университета Киорин, а также бывший научный сотрудник с докторской степенью в Калифорнийском университете в Чикаго.

    Хотя у этих мышей очень редко развивается спонтанный колит без какого-либо вмешательства в чистой окружающей среде, если их матери подвергались воздействию антибиотиков во время беременности и кормления грудью, нарушенный микробиом может передаваться детенышам в раннем возрасте. Примерно у 30% щенков с этим вертикально передающимся нарушенным микробиомом развивается колит.

    Исследователи использовали метод, известный как метагеномное секвенирование дробовика, для скрининга фекальных микробиомов мышей IL-10 -/- с дисбактериозом, вызванным антибиотиками, наряду с контрольной группой, не получавшей лечения, и выявления конкретных видов микробов, которые могли бы различать две группы. .Это привело их к представителям бактериального типа Bacteroides.

    Одним из признаков важности филума было то, что Bacteroides был в большом количестве в микробиомах нелеченных мышей, но полностью отсутствовал у мышей, подвергшихся воздействию антибиотиков. Более того, исследователи никогда не видели Bacteroides у обработанных мышей, у которых не развился колит, но они часто находили Bacteroides в кишечнике мышей, у которых действительно возникло это заболевание.

    «Эти бактерии были уничтожены ранним воздействием антибиотиков, и они были необходимы для обучения иммунной системы развитию иммунной толерантности», — сказал Чанг. «Когда эти мыши позже заразились бактериями, их иммунная система этого не заметила. Он рассматривался как чужеродный, а не как собственный, и их иммунная система реагировала на это».

    В попытке определить, может ли восстановление важного Bacteroides обратно в микробиом исправить дисбиоз, исследователи сосредоточились на особенно распространенных видах, известных как Bacteroides sp.CL1-UC (Бк). Они попытались добавить Bc обратно в микробиомы мышей с дисбактериозом в двух временных точках: в младенчестве (три недели) и во взрослом возрасте (11 недель).

    Прививка Bc молодым мышам во время критического окна развития иммунной системы скорректировала их дисбактериоз и предотвратила колит, но повторное введение Bc взрослым мышам не могло исправить дисбактериоз и даже усугубило их колит.

    «Это показывает, что вы не можете просто восстановить недостающие бактерии в любой момент времени, это должно произойти в определенное время в начале жизни, чтобы иметь положительный эффект», — сказал Чанг.«У молодых животных мы знаем, что иммунная система развивается, она наивна, ее нужно обучать, и она обучается, подвергаясь воздействию определенных видов микробов. В некотором смысле это похоже на аллергию на арахис — раннее воздействие антигена может помочь иммунной системе выдержать аллергию на арахис, но это должно произойти в течение очень ограниченного периода».

    Исследователи были удивлены, узнав, что восстановления одного микроба было достаточно для устранения пожизненного дисбактериоза, и заявили, что это показало, как относительно небольшие изменения могут оказать существенное влияние на систему.«Это похоже на высокие деревья тропических лесов Амазонки», — сказал Чанг. «Вам нужны высокие деревья, потому что без них экосистема внизу не сможет нормально развиваться. Но если у вас есть эти деревья, остальная часть экосистемы будет процветать».

    Результаты также противоречат популярным теориям происхождения ВЗК. «Существует ошибочное мнение, что колит вызывается классическим патогеном, таким как сальмонелла, и ученые потратили годы на поиск виновника», — сказал Чанг. «Но наши данные указывают на то, что эти заболевания вызываются нашими собственными комменсальными микробами.Они присутствуют в нормальном, здоровом микробиоме, но при правильных обстоятельствах и возможности они могут трансформироваться в микробы, вызывающие болезни».

    Хотя это раннее исследование было проверкой концепции, если результаты будут применимы к людям, волновые эффекты, вероятно, будут иметь далеко идущие последствия. «Это показывает, что нам, вероятно, придется переосмыслить наш подход к таким сложным иммунным нарушениям», — сказал Чанг. «Мы видим, что риск развивается в раннем возрасте — даже в утробе матери — и поэтому это имеет значение для таких практик, как кесарево сечение и искусственное вскармливание, которые могут повлиять на микробы, которым подвергается младенец.Это говорит мне о том, что нам как врачам необходимо переключить свое мышление не на то, что непосредственно предшествует этим заболеваниям, а на то, что происходит в начале жизни. Вот где мы должны вмешаться для этих пациентов».

    Исследование «Микробная реституция в раннем возрасте снижает риск колита, вызванного дисбактериозом кишечника, вызванного антибиотиками, у мышей IL-10 -/- », было поддержано Национальным институтом диабета, болезней органов пищеварения и почек (P30 DK42086, RC2DK122394). , R37 DK47722 и K01 DK111785), Чикагский исследовательский фонд GI и Исследовательский фонд Дэвида и Эллен Хоринг.Исследование стало возможным благодаря междисциплинарной группе исследователей, в которую вошли Кэндис Чам, Аки Сакатани, Карен Янг, Юэ Шань, Меган Кеннеди, Эван Кифл и Махмуд Юсеф из Чикагского университета; Савако Миёси из Чикагского университета и Медицинской школы Университета Кёрин; Том О. Дельмонт из Калифорнийского университета в Чикаго и Университета Париж-Сакле; Сонни Т.М. Ли из Калифорнийского университета в Чикаго и Канзасского государственного университета; А. Мурат Эрен из Калифорнийского университета в Чикаго и Морской биологической лаборатории; Ванесса Леоне из Калифорнийского университета в Чикаго и Университета Висконсин-Мэдисон; Шон Кроссон из Мичиганского государственного университета; Митчелл Согин из Морской биологической лаборатории; и Дионисий А.Антонопулос из Аргоннской национальной лаборатории.

    .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.