Цисты простейших это: Цисты патогенных кишечных простейших

Цисты патогенных кишечных простейших

Простейшие относятся к одноклеточным микроорганизмам. Они могут объединяться в колонии и относятся к особям, легко определяемым при проведении исследований. К основным функциям простейших относится перенесение цист и других форм, поражающих человека. Существует огромное количество данных микроорганизмов, наносящих вред организму. Они отличаются строением, спецификой поведения и местом расположения.

Причины появления цист простейших

Цисты патогенных кишечных простейших – промежуточный этап развития паразитов, наблюдающийся во время перехода от носителя к носителю. Это форма, которая находится в ожидании вплоть до заражения. При этом цисты приобретают оболочку, повышающую устойчивость к внешним раздражителям.

Существует несколько причин проникновения цист простейших в тело носителя и в большинстве случаев вина лежит на человеке. В частности, цисты попадают в организм с сырой водой, немытыми овощами, фруктами и неправильно приготовленным мясом.

• Цисты лямблии. Заражение этими организмами осуществляется несколькими путями, в том числе от домашних животных и через различные продукты.
• Тканевые цисты токсоплазмы. Это своего рода споровые формы, проникающие в организм во время приема пищи – чаще всего речь идет о мясе. Есть риск занесения цист при переливании крови, если в процессе нарушаются санитарные нормы.
• Циста балантидия. Оказывается в человеческом организме с пищей и посредством контакта с животными.
• Цисты амебы. Преимущественно находятся в немытых овощах, фруктах и зелени. Их переносчиками во многих случаях являются насекомые, в частности, мухи и тараканы. Цисты отличаются устойчивостью к хлорированию, воздействию высоких температурных значений и низкому уровню влажности.
• Цисты трихомонад
  . Заражение ими производится преимущественно воздушным путем.

Процесс заражения – не единственное действие, совершаемое цистами. В человеке они развиваются и растут, ослабляя иммунитет, вызывая различные осложнения, а также нарушая работу органов.

Какие заболевания могут вызвать паразиты?

Наименование и тип заболеваний, вызываемых простейшими, напрямую зависит от вида возбудителя. Существует несколько самих распространенных болезней, которые вызывают простейшие. Среди них можно выделить:

• Лямблиоз. Эта болезнь провоцируется лямблиями и выражается высокой температурой, аллергической реакцией, увеличением лимфоузлов. Еще более опасны возможные лямблиоза, в том числе нарушения работы нервной системы, холецистит и увеличение размеров печени.
• Токсоплазмоз. Болезнь вызывается паразитами токсоплазмы и в первую очередь резко повышает температуру тела до 39 °C. Также она выражается переходящей в мигрень головной болью, ухудшением и даже полной потерей зрения. У новорожденных токсоплазмоз вызывает отсталость в развитии, а в определенных сложных случаях может приводить к смертельным случаям.
• Трихомониаз. Источником заболевания является трихомонада. К его проявлениям можно отнести жжение, сильный зуд и выделения. Развитие болезни может привести к простатиту у мужчин и бесплодию у женщин.
• Амебиаз. Выражается активной жизнедеятельностью амеб в организме что вызывает дизентерию, расстройство пищеварения, нарушения работы головного мозга. Также может наблюдаться снижение эффективности работы иммунной системы.
• Балантидиаз. Паразиты возбуждают заболевание язвенным колитом, геморроем и дизентерией.

Проведение анализов в медицинских учреждениях

Осуществление каких-либо проверок на цисты простейших дома невозможно, а без них не установить точный диагноз. Строго не рекомендуется ставить его самостоятельно, и тем более проводить дальнейшее лечение без обращения в клиники или аккредитованные лаборатории.

С целью выявления простейших при установлении диагноза проводятся следующие виды анализов:

• Дуоденальное зондирование. Выполняется с задействованием специального зонда, при помощи которого берется материал желудочного сока и желчи.
• Анализ кала. В рамках его проведения проверяются выделения на предмет присутствия разных форм паразитов. Для этого берется проба кала, в которую добавляется эфирный раствор. Образец помещается в центрифугу, после чего обработанную частицу кала делят на четыре части и изучают с помощью микроскопа.
• Ректороманоскопия. Процедура проводится при наличии симптомов, свойственных деятельности паразитов. Для ее выполнения используется специальное устройство с металлической трубкой, аноскопом и лампочкой. С помощью данного оборудования производится осмотр посредством ввода трубки в анальное отверстие.

Лечение осуществляется только при подтверждении заражения паразитом, а также установления его класса и вида. Назначение препаратов и курса лечения – обязанность врача, не рекомендуется заниматься самолечением, используя доступную информацию из статей в газетах и интернете. Это связано с тем, что каждый микроорганизм может оказывать свое влияние и требует индивидуального подхода.

Основной задачей лечения является выведение простейших из организма. Во время прохождения выбранного врачом курса пациент находится под контролем медперсонала – он регулярно сдает пробы кала и другие анализы, а также проходит необходимые процедуры.

Анализ воды на содержание цист простейших

Современные методики позволяют обнаруживать цисты патогенных простейших кишечника не только при обследовании кала и использовании других видов анализов. Поиск цист может производиться в источниках централизованного водоснабжения, ручьях, колодцах, скважинах, а также системах коммунального водоснабжения. Проведение таких исследований позволяет снизить вероятность возникновения вышеперечисленных заболеваний и может применяться в качестве превентивной меры.

Одним из популярных способов является проведение мембранной фильтрации.

1. В ходе исследования определенный объем тестируемой воды пропускается через фильтры.
2. После этого производится смыв получаемого осадка, в котором предположительно находятся паразитарные агенты.
3. Далее после центрифугирования раствора флотанта, 4-кратно разводимого, проводится микроскопическое исследование осадка. Цисты патогенных простейших осаждаются благодаря резкому снижению его плотности.

Данный метод позволяет обнаруживать паразитарные патогены в случае содержания не менее одного экземпляра в 25 дм³ воды из водоисточников и в 50 дм³ питьевой воды.

Выживаемость цист в воде и почве зависит от их принадлежности к определенному типу. Так, цисты лямблий сохраняют жизнеспособность в воде от 15 до 70 дней, в то время как цисты амеб от 9 до 60 дней, в зависимости от ее типа. Это также следует учитывать при проведении лабораторных тестов.

Проведение анализов в лаборатории «НОРТЕСТ»

Аккредитованный испытательный центр «НОРТЕСТ» проводит анализ воды и почвы на содержание цист простейших патогенных микроорганизмов. Для осуществления исследований мы используем высокочувствительное оборудование и только проверенные методики, что позволяет рассчитывать на высокую точность результатов с минимальными погрешностями. На это также влияет регулярный контроль качества проводимых исследований.

Исследование кала на простейшие со скидкой до 50%

Lab4U — медицинская онлайн-лаборатория. Мы делаем анализы удобными, а результаты понятными, чтобы каждый человек управлял своим здоровьем.

Итак, почему без сомнений Lab4U?

• Нет регистратуры — оплачиваете анализы онлайн за 3 минуты
• Вы управляете процессом — можете перенести запись, дозаказать анализы, расшифровать результаты
• Чек шокирует — стоимость анализов в среднем в два раза ниже
• Не обязательно забирать бумажный экземпляр — мы пришлем результаты на эл. почту в момент готовности
• Путь в медцентр не более 20 минут — наша сеть вторая по величине в Москве, мы есть в 26 городах России
• Мы просто, понятно и интересно пишем про показатели здоровья
• В личном кабинете хранятся все ранее полученных результатов, вы легко сравните динамику
• Можно сдавать всей семьей — добавьте членов вашей семьи в личный кабинет и заказывайте для них анализы в пару кликов

Мы работаем с 2012 года в 26 городах России и выполнили уже более 1 000 000 анализов.

В лаборатории внедрена система TrakCare LAB, которая автоматизирует лабораторные исследования и сводит к минимуму влияние человеческого фактора.

Команда Lab4U делает все, чтобы сдавать анализы было просто, удобно, доступно и понятно. Сделайте Lab4U своей постоянной лабораторией.

Карта сайта

Адреса клиник г. Казань

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00

Автобус: 10, 10а, 18, 33, 35, 35а, 36, 44, 45, 46, 49, 55, 60, 62, 76

Троллейбус: 2, 13

Трамвай: 5, 6

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00

Автобус: 1, 2, 31, 37, 47, 74

Троллейбус: 6, 8, 12

Метро: Суконная слобода

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00 

Автобус: 5, 34, 37, 62 77

Трамвай: 5

Метро: Проспект Победы

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: выходной

Автобус: 1, 4, 25, 43, 71

Метро: Суконная слобода

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: выходной

Автобус: 6, 18, 29, 33, 37, 40, 43, 53, 62, 76, 78, 89

Троллейбус: 13

Трамвай: 1, 6

Метро: Северный вокзал

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00 

Троллейбус: 3

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00 

Автобус: 1, 19, 25, 34, 44, 60, 84

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00 

Автобус: 10, 10а

Пн-Пт: 7. 00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00 

Автобус: 6, 18, 33, 37, 40, 42, 43, 53, 60, 78, 89, 93

Троллейбус: 13

Трамвай: 1

Метро: Авиастроительная

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00 

Автобус: 5, 18, 30, 31, 34, 45, 46, 62, 63, 77, 89

Троллейбус: 3, 5, 9, 12

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: выходной

Автобус: 46, 90

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00

Автобусы: 5, 18, 30, 31, 33, 34, 45, 68, 74, 77

Троллейбусы: 5, 9, 12

Трамвай: 4

Метро: Дубравная

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8:00-14:00 

Автобусы: 10а, 36, 49, 53, 63, 72, 106

Троллейбус:1

Исследование кала для обнаружения простейших

Исследование кала позволяет выявить кишечных паразитов, относящихся к простейшим это дизентерийная амёба и жгутиковые (лямблии).

Лямблиоз — широко распространённое протозойно-паразитарное заболевание, обусловленное инвазией лямблиями. Заражение происходит через рот при попадании в организм загрязнённых лямблиями пищевых продуктов или воды, а также при занесении лямблий в рот грязными руками. Воротами инфекции являются верхние отделы тонкой кишки. В настоящее время установлено, что для развития лямблиоза достаточно заглотить несколько (до 10) цист. В организме хозяина они размножаются в огромных количествах (на 1 см слизистой оболочки кишки может находиться до 1 млн. лямблий и более). Инвазированные лямблиями лица могут выделять с испражнениями до 18 млрд. цист в течение суток. Лямблии являются строгими паразитами, они не могут питаться пищевыми частицами. Вегетативные формы могут существовать только на поверхности слизистой оболочки верхнего отдела тонкой кишки, механически блокируют слизистую оболочку тонкой кишки, нарушая пристеночное пищеварение, повреждают двигательную активность тонкой кишки.

 Амёбиаз – источником заражения является больной человек или носитель дизентерийных амёб, в 1 г. испражнений может содержаться до 6 млн. цист амёб. Характерен пищевой путь передачи (проглатывание цист с загрязнённой водой и продуктами питания). В нижнем отделе тонкой или верхнем отделе толстой кишки оболочка цисты разрушается, превращаясь в дизентерийную амебу, которая обитает в просвете толстой кишки. Это не сопровождается клиникой, может расцениваться как здоровое носительство. В некоторых случаях просветная форма может проникать в подслизистую оболочку кишки и превращаться в патогенную форму, с формированием дизентерийной язвы. Перед исследованием пациент не должен принимать в течение 7-10 дней касторовое или минеральное масло, препараты висмута и магния, антидиарейные, антибиотики. Не рекомендуется также выполнять ирригоскопию. Попадание мочи в кал недопустимо, т.к. это может вызвать разрушение паразитов, не следует брать кал из унитаза, т.к. вода токсична и может содержать сопутствующие микроорганизмы.

В норме простейшие в кале отсутствуют. Выявление амёб и лямблий подтверждает диагноз лямблиоза и амёбиаза.

Правила сбора и доставки кала на различные виды исследований

Перед исследованием не применять медикаменты, примеси которых мешают микроскопическому исследованию и влияют на внешний вид каловых масс, а также усиливают перистальтику кишечника. К таким препаратам относятся все слабительные, ваго- и симпатикотропные средства, каолин, бария сульфат, препараты висмута, железа средства, вводимые в ректальных свечах, приготовленных на жировой основе. Если у женщины в назначенное для сбора кала время имеется менструация, то получение биоматериала следует отложить до ее окончания. Нельзя собирать фекалии после клизм.

Фекалии следует брать в день исследования; опорожнять кишечник нужно в сухое судно, а не в унитаз. Собирают кал за одну дефекацию в чистую, стеклянную, сухую, герметично закрывающуюся емкость или одноразовый пластиковый контейнер с ложечкой. Для исследования нужно 5 – 10 граммов кала без примеси мочи и выделений из половых органов. Исключено использование не моющихся промокающих емкостей (спичечных коробков, например), так как при этом меняются свойства и консистенция кала.

Для сбора анализа кала на скрытую кровь три дня пациенту запрещается употреблять продукты, в состав которых входит мясо, рыба и зеленые овощи, за сутки до сбора он не должен чистить зубы.

Для обследования на простейшие и копрологическое исследование кала необходимо собрать свежий, из разных мест, в количестве 10 -15граммов и желательно еще теплый кал немедленно доставить в клиническую лабораторию.

Для паразитологического исследования кала  на яйца гельминтов и цисты простейших специальной подготовки  пациента к обследованию не требуется. Объем фекалий должен быть не менее 5 – 10 граммов кала. Если нет возможности отправить кал на это исследование в лабораторию сразу после дефекации, это можно сделать и позже, но не позднее 8 – 12 часов. Кал в таком случае нужно хранить в прохладном месте, при температуре + 4˚ С.

Для выявления паразитов в кале с консервантом Турдыева, пациент трехкратно в течение трех дней (при ежедневном стуле) собирает кал в одну пластиковую емкость с консервантом Турдыева, герметично закрывающуюся, которую он получает в клинической лаборатории; при склонности к запорам интервал сбора увеличивается. Рекомендуемый однократный объем фекалий – «с горошину». Соотношение суммарного объема трехкратно собранного материала и консерванта – 1:3. Флакон с консервирующей жидкостью при добавлении очередной порции кала встряхивают до получения гомогенной взвеси. Доставляют в клиническую лабораторию с направлением на анализ.

Цены на медицинские услуги | Асмедика

Анализ кала – недорого и быстро в «Асмедика»

Анализ кала – не самая приятная тема. Однако она становится одной из главных, когда начинают мучить совсем не приятные болезни желудочно-кишечного тракта. И вот здесь-то и выясняется, что большинство из вас уверены в том, что анализ кала в основном помогает выявить «яйца глист».

На самом деле исследование кала способно предоставить врачу намного больше исчерпывающей информации о процессах в вашем организме.

Измучили болезни ЖКТ? Чем быстрее врач выясняет ваш диагноз, тем скорее вы проходите курс лечения и избавляетесь от изнуряющих недугов. Для постановки точного диагноза заболеваний желудочно-кишечного тракта необходимо сдать анализ кала.

Врачу срочно требуются результаты ваших анализов, но вы не знаете, где сдать анализ кала в Петербурге и как это сделать правильно? Проконсультируйтесь с нами по телефону (812) 59 777 55!

Оперативная работа персонала нашей клиники «Асмедика», а также специалистов лаборатории, которым стоит доверять, позволяет вам в разумные сроки сдать анализы недорого.

Анализ кала: о чем может рассказать врачу результат вашего анализа?

Сдать анализ кала необходимо для того, чтобы выявить нарушения и патологии в биохимических процессах, которые происходят в органах пищеварения. Помимо этого, результат анализа кала очень важен в процессе лечения и выздоровления – он отражает динамику развития болезни в разных стадиях, а также подтверждает ваше излечение.

Какие исследования кала выполняет для вас «Асмедика»?

В лабораториях, с которыми мы успешно сотрудничаем годами, выполняются различные исследования кала. Среди них:

• анализ кала на яйца гельминтов и цисты простейших (анализ кала на лямблии)
• исследование кала на энтеробиоз
• копрограмма (исследование кала с расширенным набором показателей)
• анализ кала на скрытую кровь (реакция Грегерсена)

Все эти анализы кала принимаются в нашей клинике. С условиями приема вы можете ознакомиться, позвонив по телефону: (812) 59 777 55.

Что выявляет анализ кала на яйца гельминтов и цисты простейших?

Анализ кала на яйца гельминтов и цисты простейших (анализ кала на лямблии) подтверждает или опровергает то, что в вашем желудочно-кишечном тракте паразитируют такие микроорганизмы как:

1) простейшие:

• · Giardia lamblia (один из видов лямблий)
• · Trichomonas intestinalis (кишечная трихомонада)
• · Entamoeba spp. (в том числе дизентерийная амеба, кишечная амеба)
• · Blastocystis hominis (простейшие микроорганизмы, которые раньше относили к грибкам)

2) нематоды:

• Ascaris lumbricoides (большие круглые черви, паразитирующие у человека)
• Trichuris trichiura (власоглав, хлыстовик – небольшая тонкая паразитическая нитевидная нематода, обитающая в толстом кишечнике)
• · Enterobius vermicularis (острица, «глист» – контактный гельминт, возбудитель энтеробиоза)
• · Strongyloides stercoralis (угрица кишечная, возбудитель стронгилоидоза)

3) цестоды (ленточные черви): Таenia spp.

Анализ кала на яйца гельминтов и цисты простейших (анализ кала на лямблии) достоверен только тогда, когда проводятся 3 исследования кала раз в 7 дней. Ложноотрицательные результаты, к которым может привести исследование кала, обычно связаны с тем, что:

• вы неправильно подготовились для того, чтобы сдать анализ кала
• исследование кала не выявляет паразитов на ранней стадии заражения ЖКТ
• некоторые паразиты выделяются циклически, и, возможно, анализ кала был проведен в период их неактивности.

Исследование кала на энтеробиоз

Сдать анализ на энтеробиоз – еще один достоверный способ обнаружить яйца гельминтов и остриц. Для этого выполняют либо анализ кала на энтеробиоз, либо делают соскоб на энтеробиоз.

Для того чтобы анализ на энтеробиоз был достоверным, соскоб на энтеробиоз необходимо сделать сразу после сна, до мочеиспускания и гигиенических процедур. Материалы, которые вам при этом понадобятся, – это ватная палочка и специальная пробирка.

Суть процедуры самостоятельного забора анализа: собрать ватной палочкой материал с перианальных складок, поместить палочку в пробирку, в течение 3-х часов доставить в «Асмедика».

Чем неприятны острицы и гельминты? Зачем нужен анализ на энтеробиоз?

Гельминты и острицы живут и размножаются в толстом кишечнике, провоцируя различные кишечные расстройства, и выползают из прямой кишки (в основном ночью), для того чтобы отложить яйца. При этом паразиты выделяют вещества, вызывающие зуд. Иногда зуд становится нестерпимым, распространяется в области промежности, переходит на живот. У человека, зараженного паразитами, падает работоспособность, пропадает сон, появляются нервные расстройства. Чаще всего от заражения острицами и гельминтами страдают дети, поэтому им рекомендуется анализ кала на энтеробиоз или соскоб на энтеробиоз сдавать регулярно.

Что такое копрограмма?

Копрограмма – это исследование кала с расширенным набором показателей, которые подразумевают химическое, физическое и микроскопическое исследование кала. Такой анализ кала выявляет:

• нарушения функциональной деятельности желудка, поджелудочной железы, печени и кишечника
• воспалительные процессы и дисбактериоз в ЖКТ
• нарушения пищеварительного процесса, процесса кишечной секреции, ускоренную эвакуацию пищи из желудка в кишечник
• нарушение всасывания питательных веществ в тонкой и двенадцатиперстной кишке.

Копрограмма исследует:

• внешний вид (цвет, форму), массу, запах и консистенцию кала
• присутствие паразитов и микробов
• наличие примесей в кале (слизь, кровь, непереваренные остатки пищи)
• содержание в кале щелочи
• химический состав кала (содержание крови, стеркобилина, билирубина, белков, углеводов, крахмала, клетчатки и др. веществ).

Копрограмма – это очень информативный анализ кала, который позволяет четко диагностировать заболевания, воспаления, инфекции ЖКТ, а также выявлять патологические изменения и опухоли (например, содержание белка в кале свидетельствует о злокачественных новообразованиях в ЖКТ).

Анализ кала на скрытую кровь

Примесь крови (повышенное содержание гемоглобина) в кале – тревожный признак. Положительный анализ кала на кровь говорит о кровотечениях в желудочно-кишечном тракте.

Кровотечения в ЖКТ могут предполагать:

• злокачественные новообразования и воспалительные процессы в слизистых желудка и кишечника (эрозивный гастродуоденит, опухоли, дивертикулы желудка)
• дивертикулез и злокачественные опухоли кишечника
• язвы, полипозы
• геморрагические диатезы, геморрой

Результаты анализа на скрытую кровь в кале помогает определить реакция Грегерсена. Это очень высокочувствительная реакция, которая дает положительный результат уже при потере 2-5 мл. крови.

Но в таком случае анализ кала на скрытую кровь может оказаться положительным и тогда, когда наблюдаются:

• кровотечения десен и глотки
• носовые кровотечения
• варикозное расширение вен пищевода
• болезнь Крона
• гельминтозы
• неспецифический язвенный колит
• болезни крови и т.д.

Поэтому, для того чтобы правильно сдать анализ кала на скрытую кровь и получить достоверные результаты, необходимо подготовиться.

Как подготовиться, для того чтобы сдать анализ кала?

Если вам предстоит сдать анализ кала на скрытую кровь (реакция Грегерсена), подготовка к сдаче анализа займет у вас 3 дня. В течение этого времени нельзя употреблять в пищу мясные и рыбные продукты, яйца, лекарства и овощи-фрукты, содержащие железо (болгарский перец, огурцы, помидоры, зеленый лук, шпинат, яблоки, белую фасоль и др. ).

Если вам необходимо сдать анализы кала на энтеробиоз, яйца гельминтов и простейших, сделать копрограмму, в течение 3-4 дней ограничьте содержание в вашей пище белков, жиров и углеводов.

Также следует прекратить использование любых лекарственных препаратов и средств: слабительных, активированного угля, вазелинового и касторового масла, ректальных свечей, бария.

Любой анализ кала исключает исследование кала, полученного путем использования клизмы.

Кал, предназначенный для анализа, необходимо собрать в специальный контейнер (важно следить, чтобы в кале не оказалось примесей мочи!) и доставить в «Асмедика» в течение 3-5 часов. Также допускается предварительное хранение материала в холодильнике (но не в морозильнике!) в течение 10-12 часов.

С условиями приема анализов вы в любой момент можете ознакомиться, позвонив в «Асмедика» по телефону: (812) 59 777 55.

Анализ кала на простейшие (PRO stool)

Исследуемый материал Кал

Метод определения Препарат готовится методом формалиново-эфирного обогащения, затем микроскопируется.

• г. Алматы, 5 мкрн д 17 (Абая/Алтынсарина). 
•  г. Алматы, ул. Мендикулова (мкр. Самал-2), д.3 
•  г. Алматы, Бостандыкский р-н, мкр. Орбита — 4, д. 11 
•  г. Алматы, пр-кт Абая, 89

Наибольшее значение имеет обнаружение в кале следующих простейших (intestinal protozoa), вызывающих заболевания у человека:

Entamoeba Histolytica (дизентерийная амеба) вызывает амёбиаз. Встречается в кишечнике человека в двух формах. Тканевая форма вызывает изъязвление стенок кишечника. Наличие этой формы характерно для острого амёбиаза. Просветная форма характерна для выздоравливающих от острого амёбиаза, страдающих хроническим амёбиазом и носителей.

Lamblia intestinalis (лямблии) паразитируют в тонкой кишке и желчном пузыре.

Balantidium coli (балантидий) паразитирует в кишечнике человека и вызывает заболевания различной степени тяжести от лёгких колитов до тяжёлых язвенных поражений.

Литература

1. Паразитарные болезни человека (протозоозы и гельминтозы). Руководство для врачей. (Ред. Сергеева В.П., Лобзина Ю.В., Козлов С.С.) Спб., 2006. 586 стр.
2. Руководство по медицине (гл. ред. Р. Беркоу) — М.- Мир 1997, т.1 сс. 142 — 163.
3. Wallach J. Interpretation of diagnostic test Lippincott — 2000 pp. 864 — 885.
   

14.6B: Простейшие — Биология LibreTexts

1. Последнее обновление

2. Сохранить как PDF

1. Ключевые моменты
2. Ключевые термины

Простейшие — это разнообразная группа одноклеточных эукариотических организмов, многие из которых могут вызывать заболевания.

Задачи обучения

• Сравнить и сопоставить стадии пролиферации и покоя патогенных простейших и болезни, вызываемые протазоа

Ключевые моменты

• Примерами заболеваний человека, вызываемых простейшими, являются: малярия, амебиаз, лямблиоз, токсоплазмоз, криптоспоридиоз, трихомониаз, болезнь Шагаса, лейшманиоз и дизентерия.
• Стадии жизни этих простейших играют важную роль в их способности действовать как патогены и инфицировать различных хозяев.
• Protozoa считались группой-партнером простейших для protophyta, которые ведут себя как растения (например, фотосинтез). В общем, простейшие называют протистами, подобными животным, потому что они способны двигаться или передвигаться.
• Некоторые простейшие являются паразитами человека, вызывающими болезни.

Ключевые термины

• трофозоит : простейшее на стадии питания своего жизненного цикла.
• простейшие : простейшие — это разнообразная группа одноклеточных эукариотических организмов, многие из которых подвижны. Первоначально простейшие были определены как одноклеточные простейшие с поведением, подобным животным, например, движением. Protozoa считались партнерской группой простейших для protophyta, которые ведут себя как растения, например, фотосинтез.
• покоящаяся киста : стадия покоя или покоя микроорганизма
• киста : мешочек или мешочек без отверстия, обычно перепончатый и содержащий болезненное вещество, который развивается в одной из естественных полостей или в веществе органа

Простейшие (или простейшие) представляют собой разнообразную группу одноклеточных эукариотических организмов, многие из которых подвижны.Первоначально простейшие были определены как одноклеточные протисты с поведением, подобным животным (например, движением). Protozoa считались группой-партнером простейших для protophyta, которые ведут себя как растения (например, фотосинтез). В общем, простейшие называют протистами, подобными животным, потому что они способны двигаться, или подвижные . Хотя нет точного определения термина простейшие, он часто относится к одноклеточным гетеротрофным протистам, таким как амебы и инфузории.

Простейшие могут проявлять патогенность и быть причиной различных заболеваний. Стадии жизни этих простейших играют важную роль в их способности функционировать в качестве патогенов и инфицировать различных хозяев. У некоторых простейших есть стадии жизни, чередующиеся между стадиями пролиферации (например, трофозоитов) и покоящимися цистами. Как цисты, простейшие могут выживать в суровых условиях, таких как воздействие экстремальных температур или вредных химикатов, или длительные периоды без доступа к питательным веществам, воде или кислороду в течение определенного периода времени.Способность простейших процветать в экстремальных условиях способствует их способности уклоняться от ответов иммунной системы, лекарственной терапии и выживать в течение продолжительных периодов времени до заражения. Наличие кисты позволяет паразитическим видам выживать вне хозяина и позволяет им передаваться от одного хозяина к другому. Когда простейшие находятся в форме трофозоитов, они активно питаются. Преобразование трофозоита в форму цисты известно как энцистация, а процесс обратного превращения в трофозоит известен как эксцистация.

Простейшие, такие как паразиты малярии (Plasmodium spp.), Трипаносомы и лейшмании, также важны как паразиты и симбионты многоклеточных животных. Примерами заболеваний человека, вызываемых простейшими, являются: малярия, амебиаз, лямблиоз, токсоплазмоз, криптоспоридиоз, трихомониаз, болезнь Шагаса, лейшманиоз и дизентерия. Жизненный цикл простейших успешен на основе успешной передачи между хозяином и хозяином и окружающей средой.Инфекция и заболевания простейшими паразитами часто связаны с развивающимися странами с плохими гигиеническими и санитарными условиями, которые могут способствовать передаче этих простейших.

Хитиназозависимый контроль нагрузки цист простейших в головном мозге

Abstract

Хронические инфекции представляют собой непрерывную битву между иммунной системой хозяина и репликацией патогенов. Многие простейшие паразиты развили стадию жизненного цикла цисты, которая обеспечивает ей повышенную защиту от деградации окружающей среды, а также от эндогенных механизмов атаки хозяина.В случае Toxoplasma gondii эти цисты преимущественно обнаруживаются в иммунно-защищенном мозге, что затрудняет выведение паразита и приводит к пожизненной инфекции. В настоящее время мало что известно о природе иммунного ответа, вызванного наличием этих кист, или о том, как они могут размножаться. Здесь мы устанавливаем новый зависимый от хитиназы механизм контроля кист в инфицированном мозге. Несмотря на доминирующий иммунный ответ Th2 во время инфекции Toxoplasma, в инфицированной ЦНС существует популяция альтернативно активированных макрофагов (AAMØ). Эти клетки способны к лизису цист за счет продукции AMCase, как показывает визуализация в реальном времени, и эта хитиназа необходима для защитного иммунитета в ЦНС. Эти данные демонстрируют активность хитиназы в головном мозге в ответ на простейшие патогены и обеспечивают новый механизм, способствующий очищению кисты во время хронических инфекций.

Сведения об авторе

Здесь описывается новый механизм выведения цист простейших в ЦНС во время хронической инфекции. Эти данные показывают присутствие в мозге популяции альтернативно активированных макрофагов, которые секретируют активную хитиназу, AMCase, в ответ на хитин в стенке кисты.Используя как химическое, так и генетическое ингибирование in vitro, было обнаружено, что этот фермент необходим для эффективной деградации и разрушения кисты. Необходимость AMCase продемонстрирована in vivo, поскольку отсутствие фермента привело к значительному увеличению нагрузки на кисты и снижению выживаемости при хронической инфекции. Вместе эти данные определяют важный механизм борьбы с паразитами и очищения ЦНС от кист. В настоящее время не существует методов лечения, которые привели бы к полному избавлению мозга от этого паразита.Следовательно, понимание естественных механизмов выведения кист может привести к новым и эффективным методам лечения этой и других хронических инфекций.

Образец цитирования: Nance JP, Vannella KM, Worth D., David C, Carter D, Noor S, et al. (2012) Хитиназозависимый контроль нагрузки цист простейших в головном мозге. PLoS Pathog 8 (11): e1002990. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002990

Редактор: Эрик Ю.Денкерс, Корнельский университет, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 08.05.2012; Одобрена: 10 сентября 2012 г .; Опубликовано: 29 ноября 2012 г.

Это статья в открытом доступе, свободная от всех авторских прав, и ее можно свободно воспроизводить, распространять, передавать, модифицировать, надстраивать или иным образом использовать в любых законных целях. Работа сделана доступной по лицензии Creative Commons CC0 как общественное достояние.

Финансирование: Эти исследования были частично поддержаны грантами EHW от CRCC, Отделения биомедицинских наук UCR, академического сената UCR и NIH RNS071160A и RNS072298A, а также TEL от NIH R01NS041249.TAW поддерживается программой очных исследований Национального института аллергии и инфекционных заболеваний / NIH. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: LF и CH работают в Pfizer. Это не влияет на нашу приверженность всем политикам PLOS Pathogens в отношении обмена данными и материалами. Все остальные авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Мозг имеет уникальные структуры, ограничивающие доступ иммунных клеток и молекул.Хотя это может обеспечить защиту от чрезмерно амбициозной воспалительной реакции, это также может привести к высокому распространению латентных и хронических инфекций, которые могут сохраняться в этом месте. Удаление таких патогенов имеет свои особые проблемы в органе, плотно заселенном чувствительными нейронами и узкими воротами для инфильтрации иммунных клеток. Toxoplasma gondii — это обычный внутриклеточный простейший паразит, который вызывает хроническую инфекцию в головном мозге на протяжении всей жизни хозяина. Инфекция частично контролируется с помощью эффекторных механизмов макрофагов, которые приводят к превращению быстро реплицирующихся тахизоитов в медленно реплицирующиеся, образующие цисты брадизоиты [1] — [3].Кисты могут образовываться во всех тканях, но существуют преимущественно в головном мозге на протяжении всей жизни хозяина, что требует постоянного иммунного ответа для предотвращения реактивации кист и токсоплазматического энцефалита, частой причины смертельных случаев, связанных со СПИДом [4], [5]. Индуцированный инфекцией иммунный ответ в головном мозге состоит из активированных резидентных клеток ЦНС, включая астроциты и микроглию, инфильтрирующих CD4 + и CD8 + Т-клетки, периферических макрофагов и существенного ремоделирования тканей [6] — [8]. Такая иммунная активность в головном мозге часто связана с патологическим исходом, но, несмотря на высокую распространенность инфекции, токсоплазма, по-видимому, контролируется без неблагоприятных неврологических повреждений.Механизмы, которые участвуют в передаче и контроле такого потенциально патологического иммунного ответа в ЦНС, только начинают пониматься [6], [8] — [11]. Киста и образующие цисты брадизоиты слабо иммуногенны [12], [13], и хотя мы уже некоторое время знаем, что Т-клетки необходимы для предотвращения реактивации кисты [4], [5], [14], очень мало известно. о биологии этой структуры в головном мозге. Хотя доступны препараты против токсоплазмы, которые эффективно контролируют тахизоит, пока не существует методов лечения, которые могли бы эффективно удалить кисту формы паразита.Таким образом, постоянное присутствие кист токсоплазмы в головном мозге представляет критическую и постоянную опасность для пациента с ослабленным иммунитетом.

Широко распространено мнение, что цисты остаются внутриклеточными в нейронах, возможно, сводя к минимуму их контакт с защитными системами хозяина [15]. Однако уже некоторое время известно, что нагрузка на кисты достигает пика, снижается и со временем становится стабильной, что указывает на некоторую форму эффекторного механизма, который может воздействовать на эту стадию паразита [16]. Исследования показали, что CD8 + Т-клетки продуцируют перфорин в клиренсе кист, у мышей с дефицитом перфорина наблюдается более высокая нагрузка на кисты и повышенная восприимчивость на хронической стадии инфекции [17], [18].Тем не менее, гистологический анализ этих исследований, а также недавние живые изображения клеточных взаимодействий в ЦНС [19] демонстрируют накопление моноцитов и контакт с кистами.

В последние годы наше понимание макрофагов расширилось, и теперь мы ценим замечательную пластичность этих клеток. Таким образом, хотя целые популяции макрофагов могут стать поляризованными к классическим или альтернативным фенотипам, связанным с защитой от простейших и гельминтов соответственно, способность реагировать и адаптироваться к местным раздражителям в окружающей среде имеет первостепенное значение [20] — [24].Роль классически активированных макрофагов в борьбе с инфекцией T. gondii хорошо задокументирована. Эти клетки являются источником IL-12, активных форм кислорода и азота, а также GTPases, которые позволяют напрямую убивать паразита [6], [25] — [30]. Однако здесь мы описываем популяцию макрофагов CXCR3 + в головном мозге после заражения T. gondii . Эти клетки экспрессируют акцепторные рецепторы MMR и стабилин-1 и продуцируют аргиназу в ответ на присутствие цист токсоплазмы.В дополнение к этим традиционным признакам альтернативной активации, эти исследования демонстрируют, что макрофаги реагируют на хитин, присутствующий в стенке кисты, и продуцируют настоящую хитиназу млекопитающих, AMCase. Наконец, мы показываем, что эта хитиназная активность разрушает кисты и имеет важное значение для контроля количества кист в хронически инфицированном мозге.

результатов

Популяция AAMØ в мозге, инфицированном

Недавние исследования выявили значительное увеличение ремоделирования тканей в головном мозге при хроническом течении T.gondii [8]. Кроме того, существует постоянная потребность в удалении мусора из разорванных кист и мертвых клеток головного мозга [31]. Чтобы выяснить, присутствует ли AAMØ, известная своей ролью в ремоделировании тканей и гомеостатическом клиренсе, во время такого события в ЦНС, популяции макрофагов из инфицированного мозга были фенотипически проанализированы на предмет экспрессии известных маркеров альтернативной активации. Одной из ключевых молекул, которые были связаны с фенотипом ремоделирования ткани макрофагов в ЦНС, является экспрессия CXCR3 на микроглии [32], [33].CXCR3 необходим для защитных иммунных ответов на T. gondii в первую очередь из-за его роли в рекрутировании Th2-клеток и, в последнее время, для стратегий поиска Т-клеток в головном мозге [34] — [37]. Действительно, CXCR3 и его лиганды значительно активируются в головном мозге в момент времени, связанный со значительным притоком Т-клеток в ЦНС после инфекции (рис. S1A, B), при этом ~ 35% Т-клеток экспрессируют CXCR3 (рис. 1A). Однако, помимо этой хорошо изученной роли Т-клеток, существует небольшая, но отличная популяция макрофагов, которые экспрессируют высокие уровни CXCR3 (~ 10% от общего количества макрофагов) (Рисунок 1B).Существует также конститутивная, хотя и более низкая, экспрессия CXCR3 резидентной микроглией ЦНС, которая остается неизменной после инфицирования (Рисунок S1C).

Рисунок 1. Альтернативно активированные макрофаги в головном мозге во время хронической инфекции T. gondii .

(A – C) Мышей C57Bl / 6 инфицировали штаммом Me49 из T. gondii и умерщвляли на 28 день после инфицирования (p.i.). Мононуклеарные клетки мозга (BMNC) выделяли и анализировали на поверхностную экспрессию CXCR3 и MMR.Среднее значение ± SEM процента клеток CXCR3 + в виде доли (A) CD3 + Т-клеток (B) CD45 ^hi / CD11b + макрофагов. (C) Среднее значение ± SEM в процентах MMR-положительных клеток из макрофагов CXCR3- (слева) и CXCR3 + (справа). (D – F) Мыши C57Bl / 6 были инфицированы штаммом Me49 T. gondii . Нейтрализующие антитела к CXCR3 и CXCL10 вводили, начиная с 21 дня после заражения, и мышей умерщвляли на 28 день после заражения. (D) Абсолютный подсчет популяций макрофагов был получен из доли BMNC CD45 ^hi / CD11b +, умноженной на общее количество живых BMNC.(E – F) РНК выделяли и подвергали обратной транскрипции, а кДНК анализировали на уровни транскриптов CCL2 (E) и CCL5 (F) с помощью qRT-PCR. (G) BMNC были выделены от мышей через 4 недели p.i. и клетки CD11b + очищали магнитным способом путем положительной селекции. РНК выделяли и подвергали обратной транскрипции, а кДНК анализировали на уровни транскрипта MMR с помощью qRT-PCR. Результаты показаны как абсолютное количественное определение MMR с использованием стандартной кривой в виде отношения к HPRT. (H – J) Конфокальная флуоресцентная микроскопия срезов мозга 20 мкм, взятых у мышей через 4 недели после заражения.(H) Панели слева направо показывают MMR (зеленый), макрофаги Iba-1 + (красный) и объединенные изображения в инфицированном мозге с масштабной полосой DAPI (синий) = 13 мкм. (I) Панели слева направо показывают MMR (зеленый), Stabilin1 (красный) и объединенные изображения в инфицированном мозге с масштабной полосой DAPI (синий) = 21 мкм. (J) Панели слева направо показывают лектин томата (зеленый), стабилизин1 (красный) и объединенные изображения в инфицированном мозге с масштабной полосой DAPI (синий) = 42 мкм. (K) BMNC были выделены от мышей через 4 недели p.i. и клетки CD11b + очищали магнитным способом путем положительной селекции.РНК выделяли и подвергали обратной транскрипции, а кДНК анализировали на уровни транскрипта аргиназы с помощью qRT-PCR. Результаты представлены как абсолютное количественное определение аргиназы с использованием стандартной кривой в виде отношения к HPRT. Данные представлены как среднее ± SEM, * p <0,05.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002990.g001

Чтобы подтвердить, что экспрессия CXCR3 связана с альтернативной активацией макрофагов, экспрессия рецептора скавенджера «рецептор макрофагов маннозы» (MMR; также известный как Mrc1 и CD206), ключевой индикатор фенотипа AAMØ [38].Здесь мы показываем, что экспрессия MMR ограничена макрофагами и микроглией, которые также экспрессируют CXCR3 (Рисунки 1C и S1D). Напротив, эти клетки не экспрессировали IL-10, что исключает противовоспалительный фенотип (рисунок S1E) [39]. Истощение с использованием блокирующих антител к CXCR3 или его лиганду, CXCL10, привело к значительному снижению рекрутирования Т-клеток и обратному увеличению количества паразитов (рис. S2). Однако, кроме того, доля макрофагов в головном мозге была значительно снижена (рис. 1D), несмотря на отсутствие дефектов в хемокинах, привлекающих макрофаги (рис. 1E, F), что подтверждает роль CXCR3 в поддержании этой популяции клеток.

Для количественной оценки экспрессии MMR макрофагами и микроглией в инфицированном мозге проводили qRT-PCR на магнитно-изолированных клетках CD11b + из мозга наивных и инфицированных животных. Наши результаты показывают примерно 3-кратное увеличение экспрессии MMR в популяциях макрофагов от инфицированных мышей по сравнению с наивными (рис. 1G). Подтверждение наличия этой популяции в головном мозге было выявлено с помощью иммуногистохимического анализа. Макрофаги MMR + наблюдались как небольшие и дискретные популяции IBA-1 + или лектин + клеток томата, подтверждающие источник MMR на макрофагах или микроглии (Фигуры 1H, I).Еще одним функциональным маркером альтернативной активации является скавенджер-рецептор стабилин-1 [40]. Стабилин-1 участвует в очистке от трупов клеток, а также в поглощении компонентов внеклеточного матрикса [41], [42]. Экспрессия MMR совмещена со стабилизатором-1 и маркерами микроглии / макрофага, что подтверждает, что эти клетки демонстрируют альтернативно активированный фенотип (Фигуры 1H, I). Эти популяции клеток часто обнаруживались в непосредственной близости от интактных и разрушающихся цист T. gondii в ЦНС (рис. 1J и S3).

Важной особенностью AAMØ является способность клетки продуцировать аргиназу-1, которая действует на ее субстрат, L-аргинин, продуцируя L-орнитин, предшественник коллагена [43]. L-аргинин также является субстратом для NO-синтазы, и два фермента конкурируют за доступность субстрата и регулируются цитокинами типа Th2 и Th3 [44], [45]. Предыдущие исследования показали, что прямое инфицирование макрофагов тахизоитами T. gondii может индуцировать экспрессию аргиназы через STAT-6-зависимые и независимые пути [46] — [48].Кроме того, эти исследования предполагают, что такая индукция представляет собой стратегию выживания, задействованную паразитом для подавления уничтожения посредством NO. Чтобы оценить, продуцируют ли макрофаги и микроглия в инфицированном мозге аргиназу, CD11b + BMNC из инфицированных мышей выделяли и анализировали на экспрессию аргиназы-1 с помощью qRT-PCR. Наши результаты показывают почти двукратное увеличение экспрессии аргиназы-1 в клетках инфицированного мозга по сравнению с наивными (рис. 1K). Таким образом, во время хронической инфекции T. gondii существует популяция AAMØ в ЦНС, характеризующаяся экспрессией CXCR3, MMR, стабилина-1 и продукцией аргиназы-1.

Альтернативно активированные макрофаги секретируют активную хитиназу в ЦНС в ответ на хитин в стенке кисты

Во время хронической инфекции существует несколько форм паразита, которые могут быть источником связанного с инфекцией стимула для альтернативной активации макрофагов в ЦНС. Поскольку скрытые кисты являются наиболее распространенной формой инфекции в головном мозге, привлекательным кандидатом на роль источника этого стимула является присутствие хитина в стенке кисты [49], [50], поскольку было показано, что присутствие хитина вызывает рекрутирование макрофагов, которые имеют альтернативно активированный фенотип [51], [52].Чтобы определить, могут ли источники T. gondii вызывать альтернативную активацию, тахизоиты, брадизоиты и цисты были добавлены к культурам макрофагов, полученных из костного мозга (BMDM), и было измерено производство мочевины, последующего продукта аргиназной активности [53] . Кроме того, растворимый антиген, полученный из размороженных тахизоитов (sTAg) и целых цист (cystAg), оценивался на предмет их способности индуцировать мочевину (рис. 2A). Наши результаты показывают базовое производство мочевины в нестимулированных (средах) культурах макрофагов, возможно, из-за присутствия M-CSF [54].Это значительно увеличилось (p <0,001) во время поляризации AAMØ с помощью IL-4. Несмотря на известную способность тахизоитов индуцировать продукцию аргиназы [46], заражение макрофагов тахизоитом не привело к значительному образованию мочевины (рис. 2А). Это можно объяснить использованием штамма типа II, который является слабым индуктором аргиназы-1 [47], [48]. Важно отметить, что добавление цист или антигена кисты, но не «голых» брадизоитов, действительно привело к значительному увеличению продукции мочевины, хотя и не так сильно, как индукция альтернативной активации IL-4 [38], [55].Это указывает на компоненты стенки кисты как на стимул для AAMØ. Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что макрофаги могут быть альтернативно активированы присутствием цист T. gondii , но не свободными размножающимися паразитами.

Рисунок 2. Макрофаги продуцируют активную хитиназу в ЦНС в ответ на присутствие кист.

(A) BMDM анализировали на активность аргиназы путем измерения мочевины. BMDM культивировали в течение ночи с тахизоитами, sTAg, брадизоитами, целыми цистами, cystAg, цистами, разделенными 5-мкм мембранами через лунки (цисты / TW), IL-4 или одной средой и измеряли содержание мочевины колориметрически.(B) Мыши C57Bl / 6 были инфицированы штаммом Me49 из T. gondii ., Умерщвлены на 28 день p.i. лизаты из цельного мозга анализировали на активность хитиназы флуорометрически. (C) qRT-PCR анализ экспрессии AMCase из РНК всего мозга, нормализованной до GAPDH. (D) BMDM анализировали на активность хитиназы флуорометрически. Макрофаги культивировали с тахизоитами, sTAg, брадизоитами, целыми цистами, cystAg, цистами, разделенными 5-мкм мембранами через лунки (цисты / TW), IL-4 или одной средой.(A – D) Данные представляют не менее 3 отдельных экспериментов с минимумом n = 3 и представлены как среднее ± SEM, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002990.g002

Активность хитиназы была продемонстрирована в определенных популяциях AAMØ как у мышей, так и у людей [52], [56], [57]. Хитинолитическая активность макрофагов также участвует в защите хозяина от хитинсодержащих грибковых патогенов [56], [58].Чтобы проверить, индуцируется ли активность хитиназы инфекцией Toxoplasma , был проведен анализ хитиназы на лизатах цельного мозга от наивных и инфицированных животных. Три хитиновых субстрата, меченные 4-метилумбеллифероном (4MU), использовали для оценки типа присутствующей хитиназной активности. При гидролизе 4MU высвобождается, и его можно измерить флуорометрическим методом для определения хитолитической активности. Наши данные показывают, что активность хитиназы значительно увеличивается в мозге инфицированных мышей по сравнению с группой наивных только на одном из трех субстратов (рис. 2В).Этот субстрат, 4MU N-ацетил-β-D-глюкозаминид, подходит для обнаружения активности экзохитиназы, когда фермент разрушает невосстанавливающий конец хитина [59]. Несколько исследований связали хитиназы и хитиназоподобные белки с воспалением [58] — [60]. Это семейство из 18 гликозилгидролаз обычно индуцируется во время иммунных ответов типа Th3 и играет роль в ремоделировании тканей, фиброзе и модуляции как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа [60]. Кислая хитиназа млекопитающих (AMCase) и хитотриозидаза (CHIT1) являются уникальными членами этого семейства в том смысле, что они обладают ферментативно активным доменом, который гидролизует связи β 1–4, которые существуют в хитине [56], [58].Анализ с использованием qRT-PCR продемонстрировал значительную активацию AMCase, но не CHIT1. Кроме того, хитиназоподобный белок Ym-1 (Chi313) также активизировался после заражения (фиг. S4). Известно, что эта молекула ингибирует продукцию IL-12 и вызывает альтернативную активацию в макрофагах [25], [61], [62]. В отличие от Ym-1, который был связан с продукцией AMCase макрофагами в легких и дыхательных путях [63], Ym-2 и BRP-39 не были активированы в инфицированном мозге (рис. 2C, S4).Поскольку было показано, что хитин активирует и рекрутирует AAM0, возможно, что стенка кисты может служить стимулом для активности хитиназы в этой популяции клеток. Для дальнейшего тестирования BMDM культивировали совместно с различными формами паразита. Добавление тахизоитов, брадизоитов или sTAg не привело к продукции хитиназы (рис. 2D). Напротив, живые цисты и антиген кисты привели к значительному увеличению активности хитиназы, которая исчезла после обработки кист хитиназой (рис. 2D, S4).Кроме того, обработка ИЛ-4 для индукции альтернативной активации в макрофагах не приводила к увеличению активности хитиназы. Действительно, измерение IL-4, IL-4Rα и IL-4-зависимого RELM-α [64] — [66] в мозге хронически инфицированных мышей не показало значительного увеличения по сравнению с наивными мышами (Рисунок S4). Эти данные предполагают, что присутствие хитина в стенке кисты индуцирует фенотип макрофагов, характеризующийся продуцированием ферментативно активной хитиназы, AMCase, и отличается от индуцированной IL-4 активации.

Предыдущая работа показала, что макрофаги тесно связаны с разрывными кистами [17], [31], и присутствие активной хитиназы может указывать на роль этих клеток в разрушении кист в головном мозге. Распознавание хитина макрофагами зависит от размера и, вероятно, от контакта [49], [58], [67]. Чтобы проверить это, мы совместно культивировали цисты, отделенные от макрофагов, с использованием вставок из лунок размером 5 мкм и проанализировали активность мочевины и хитиназы, как описано ранее (рис. 2A, 2D).Наши результаты не показывают увеличения продукции мочевины или активности хитиназы из макрофагов, которые были отделены от цист, подтверждая, что наблюдаемая альтернативная активация зависит от контакта с цистами или антигеном кисты.

Иммуногистохимический анализ местоположения макрофагов, секретирующих AMCase, в инфицированном мозге показывает, что они находятся в непосредственной близости с тканевыми кистами (Рисунки 3A – C). По отношению к макрофагам и микроглии в головном мозге альтернативно активированные клетки составляют меньшинство, и было невозможно найти такие клетки в наивном мозге.Тем не менее, кисты легко идентифицируются с очень сферической отчетливой морфологией, могут окрашиваться неспецифично и специфично с помощью антител, а отдельные брадизоиты внутри кисты видны при окрашивании DAPI. Исследование локализации хитиназы в инфицированном мозге выявило отчетливое цитоплазматическое окрашивание нескольких клеток, почти все из которых находились в пределах 75 мкм от кисты (рис. 3А). Хотя были клетки, которые были AMCase-положительными, но не окрашивались положительно на маркеры макрофагов / микроглии, явно было несколько макрофагов, тесно связанных с кистами, которые проявляли активность хитиназы, поляризованную к стенке кисты (Рисунок S5, стрелки).Активность AmCase также наблюдалась в макрофагах, окружающих цисты, которые, по-видимому, находились в процессе лизирования, или цистах, которые были лизированы (Рисунки 3B, C и видео S1). Приведенные примеры демонстрируют разрушение сферической кисты (видео S1) и побег паразитов, визуализированные с помощью антител против токсоплазмы. Непосредственно в месте разрыва находятся макрофаги, экспрессирующие AMCase (Фигуры 3B). Взятые вместе, эти данные предполагают, что индукция активности хитиназы в макрофагах происходит в непосредственной близости со стенкой кисты и что эта особая популяция макрофагов отвечает за атаку длительной хронической стадии кисты токсоплазмы посредством активности хитиназы.

Рисунок 3. Хитиназа, экспрессирующая AAMØ, находится в тесной ассоциации с кистами в ЦНС.

(A – C) Конфокальная флуоресцентная микроскопия срезов мозга 20 мкм, взятых у мышей через 4 недели после заражения. Зеленый: томатный лектин, маркирующий макрофаги; красный: AmCase; синий: ядра, маркирующие DAPI; белый: токсоплазма. (A) Низкое увеличение (шкала = 37 мкм) (B) Большое увеличение (шкала = 13 мкм) (см. Также видео S1), стрелки указывают на области потенциального разрыва кисты, совпадающие с AMCase, экспрессирующими макрофаги, и (C) сильное увеличение ( масштабная линейка = 14 мкм).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002990.g003

Активность хитиназы макрофагов необходима для лизиса цист in vitro

Преобладает мнение, что кисты в головном мозге остаются внутриклеточными внутри нейронов и что выработка перфорина CD8 + Т-клетками отвечает за клиренс кист в головном мозге, хотя точный механизм разрушения кист еще не описан [17], [18]. Чтобы определить, может ли активность хитиназы макрофагов быть ответственна за прямой лизис цист, BMDM культивировали совместно с цистами; с аллозамидином, ингибитором хитиназы, и без него.За культурами наблюдали в течение 14 часов, снимая изображения каждые 10 минут. Кисты, наблюдаемые в отсутствие макрофагов, оставались неповрежденными в течение всего периода времени, что свидетельствует об отсутствии внутреннего механизма разрушения кисты, присущего паразитам (рис. 4A; видео S2). Напротив, добавление 20 мкг / мл хитиназы триходермы к культурам кист приводило к быстрому разрыву цист в среднем в течение 4 часов, высвобождая брадизоиты в среду (рис. 4B; видео S3). Поразительно, но цисты, которые были культивированы с макрофагами, подверглись интенсивной атаке.Это включало эффективную и быструю миграцию макрофагов к кисте, создавая кластеры макрофагов, которые можно было увидеть, тянущиеся за стенку кисты (рис. 4C; видео S4). В этих культурах большинство цист были разрушены в течение периода наблюдения со средним временем выживания 9,5 часов (рис. 4E). Напротив, цисты, культивированные в присутствии макрофагов и аллозамидина, ингибитора хитиназы, выживали значительно дольше, чем в необработанных культурах. Хотя, по-видимому, не было никаких дефектов в привлечении и активности макрофагов к кистам с аналогичной кластеризацией и «вытягиванием» стенки кисты, большинство кист выжили в течение всего 14-часового периода при обработке 100 мкМ или 10 мкМ аллозамидина (рис. 4D; Видео S5).Снижение концентрации аллозамидина привело к дозозависимому уменьшению времени выживания кисты (рис. 4E). Эти результаты демонстрируют, что макрофаги могут индуцировать лизис кисты хитиназозависимым образом.

Рис. 4. Хитиназа макрофагов необходима для лизиса цист in vitro.

(A – E) Цисты, очищенные из мозга мышей, инфицированных Me49, культивировали с BMDM или без него в 96-луночном планшете. Культуры визуализировали с использованием микроскопа пути HT в течение 14 часов. Изображения собирали каждые 10 минут и рассчитывали время выживания кисты (A – D) Покадровые изображения были получены для (A) только кист без макрофагов, (B) кист, обработанных 10 мкг / мл хитиназы триходермы, (C) кист с макрофаги и (D) цисты с макрофагами, обработанные 100 мкМ аллозамидина.(E) График концентрации аллозамидина и времени выживания кисты. Данные представляют не менее 3 отдельных экспериментов с минимальным числом n = 6 и представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего * p <0,05.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002990.g004

Хотя AMCase и CHIT1 активируются при определенных бактериальных и нематодных инфекциях [68], [69] только AMCase значительно увеличилась в мозге после заражения токсоплазмой. (Рисунок 2C). Чтобы подтвердить, что AMCase отвечает за наблюдаемую активность хитиназы, мы выполнили анализ хитиназы, аналогичный показанному на рисунке 1D, с использованием BMDM от мышей WT и AMCase нулевых мышей (рисунок 5A).Наши результаты показывают серьезный дефект продукции хитиназы нулевыми макрофагами AMCase. Действительно, эти клетки показали значительно более низкий исходный уровень хитиназы и не реагировали на добавление цист. Чтобы проверить, зависит ли способность разрушать цисты от этого фермента, BMDM мышей WT и AMCase — / — флуоресцентно метили и культивировали с цистами, экспрессирующими Me49-RFP, и визуализировали время лизиса кист, как и раньше. Использование флуоресцентно меченых паразитов улучшило способность видеть убегающих паразитов из лизирующих цист.Результаты, как и ранее, продемонстрировали, что неполяризованные макрофаги дикого типа были способны лизировать кисты за ~ 10 часов (рисунки 5B и 5D; видео S6 и S10). Напротив, цисты, культивированные с макрофагами AMCase — / -, имели значительно увеличенное время выживания по сравнению с макрофагами WT, что согласуется с тем, что AMCase является источником активности хитиназы, необходимой для лизирования цист (рисунки 5C и 5D; видеоролики S7 и S11). Чтобы определить необходимость поляризации макрофагов для их способности лизировать цисты, макрофаги обрабатывали цитокинами, чтобы поляризовать их до классических или альтернативных фенотипов перед добавлением кист.В соответствии с отсутствием индукции хитиназы, прайминг IL-4 не влиял на время выживания кист, предполагая, что индуцированная цитокинами альтернативная активация не увеличивает способность разрушать цисты (Фигуры 5D; Видео S9). Напротив, макрофаги, которые были классически поляризованы с помощью LPS и IFN-γ, демонстрировали дефект активности хитиназы и разрушение кист (рисунки 5D и 5E; видео S9). Предполагается, что поляризация макрофагов необходима, но наиболее вероятным источником альтернативной активации является хитин, а не IL-4.Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что макрофаги лизируют цисты AMCase-зависимым способом in vitro .

Рисунок 5. Кислая хитиназа млекопитающих необходима для лизиса цист in vitro.

(A) BMDM от мышей WT и AMCase — / — анализировали флуорометрически на активность хитиназы. Активность хитиназы из макрофагов WT и AMCase — / -, культивированных с брадизоитами, тахизоитами, целыми цистами, IL-4 или только средой. (B – D) Цисты Me49-RFP, очищенные из мозга инфицированных мышей, культивировали с BMDM, меченным зеленым цветом CellTracker, или без него, от мышей WT или AMCase null.Культуры визуализировали с использованием микроскопа пути HT в течение 16 часов. Изображения собирали каждые 10 минут и рассчитывали время выживания кист. (B – C) покадровые изображения были получены из культур кист (B) макрофагов WT или (C) макрофагов AMCase — / -. (D) Графическое представление времени выживания кисты более 16 часов. (E) Хитиназная активность макрофагов, полученных из костного мозга дикого типа, культивированных с целыми кистами, целыми кистами + LPS / IFN-γ или только средой. Данные представляют не менее 3 отдельных экспериментов с минимальным n = 6 и представлены как среднее значение ± SEM, * p <0.05, ** p <0,01 *** p <0,001.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002990.g005

AMCase-зависимый контроль бремени паразитов in vivo

Последствия зависимого от хитиназы лизиса цист в ЦНС потенциально могут принести пользу как хозяину, так и паразиту. Если бы убегающие брадизоиты были быстро убиты макрофагами или ассоциированными иммунными клетками, мы могли бы ожидать, что этот механизм принесет пользу хозяину и приведет к снижению нагрузки паразитов. И наоборот, если брадизоиты способны размножаться и заражать новые клетки, это может быть механизмом, который способствует сохранению паразита в головном мозге.Чтобы исследовать роль AMCase в мозге in vivo , мы инфицировали мышей WT и AMCase-дефицитных мышей и проанализировали иммунный ответ и бремя паразитов в отсутствие активности хитиназы. Чтобы определить, требуется ли AMCase во время острой стадии инфекции, образцы ткани легких были взяты на 7 день и проанализированы на наличие паразитов с помощью qPCR. Не было обнаружено значительных различий в паразитарной нагрузке в легких, а концентрации цитокинов в сыворотке крови были одинаковыми на протяжении всей острой инфекции (рис. 6A – F).Таким образом, недостаток AMCase не приводит к недостаточным иммунным ответам на ранней стадии заражения на периферии. Через 5 недель после заражения, когда системное воспаление было под контролем и паразиты локализованы исключительно в головном мозге, преимущественно в виде цист, содержащих брадизоиты [67], [70], оценивалась паразитарная нагрузка. В отсутствие AMCase наблюдалось значительное увеличение (p = 0,0014) примерно в 2 раза общего количества, но не размера кист в головном мозге (рисунки 6G и 6H). Различия в количестве кист не наблюдались через 3 недели после инфицирования (рис. S6), период, представляющий переход между острой и хронической инфекцией, что также свидетельствует о том, что увеличение количества кист происходит из-за событий в ЦНС во время хронической инфекции.Кроме того, общая нагрузка паразитов в ЦНС, измеренная с помощью кПЦР, была значительно больше, чем в 2 раза (p = 0,0055) (рис. 6I), коррелируя с появлением большего количества кист гистологически (рис. 6J). Кроме того, нагрузка паразитов оценивалась с помощью RT-qPCR со стадиями специфичных праймеров, идентифицирующих тахизоит (SAG1), брадизоит (SAG4) и цисту (MAG1) специфические транскрипты [71] (Рисунок S6). Наши результаты показывают аналогичное увеличение количества паразитов для всех трех транскриптов, предполагая, что лизис кисты также является важным механизмом для контроля инвазивных форм паразита.Анализ проточной цитометрии не выявил различий в инфильтрирующих CD4 +, CD8 + Т-клетках или популяциях макрофагов (рис. 6K). Следовательно, увеличение количества паразитов не связано с дефектом инфильтрации эффекторных иммунных клеток. Кроме того, мыши AMCase — / — не выжили и умерли от инфекции, начиная с шести недель (p = 0,0177) (рис. 6L). Хотя некоторая острая смертность была отмечена в нескольких экспериментах, значимость была достигнута только при учете хронической смертности. Эти результаты демонстрируют, что активность AMCase необходима для защитного иммунного ответа на T.gondii во время хронической инфекции в головном мозге, и лизис кист в ЦНС, опосредованный AMCase, является полезным механизмом для хозяина, контролирующего бремя паразитов на нелетальных уровнях.

Рисунок 6. Мыши AMCase — / — имеют более высокое количество паразитов в головном мозге и умирают от инфекции во время хронической стадии.

(A – F) Мыши C57Bl / 6 (WT) и AMCase — / — были инфицированы штаммом Me49 из T. gondii . Сыворотку выделяли из образцов цельной крови на 3, 7 и 14 дни после инфицирования и анализировали на (A) IFN-γ, (B) IL-6, (C) MCP-1, (D) TNF-α, (E) IL-12p70 (F). На 7 день ДНК выделяли из легких и анализировали на наличие паразитов с помощью кПЦР.Результаты отображаются в виде паразитов на мг ткани. (G-K) Мышей C57Bl / 6 (WT) и AMCase — / — инфицировали штаммом Me49 из T. gondii и умерщвляли через 5 недель после заражения. Мозг собирали и анализировали на наличие кист, клеточный состав и гистологию. (G) Подсчет кист был получен из гомогенизированных образцов всего мозга. (H) Площадь кисты, 20 кист от каждой мыши были сфотографированы под микроскопом и площадь кисты была определена с использованием программного обеспечения ImageJ. (I) ДНК из головного мозга WT и AMCase — / — была выделена и проанализирована на наличие паразитов с помощью кПЦР.(J) Целый мозг фиксировали, замораживали и окрашивали на H&E, чтобы исследовать кисту и патологию. (K) BMNC были выделены и проанализированы на экспрессию CD4 + T-клеток, CD8 + T-клеток, макрофагов (CD45 ^hi / CD11b +) и микроглии (CD45 ^hi / CD11b +) с помощью проточной цитометрии. Достоверность определялась с использованием логарифмического рангового теста с p = 0,0177. Данные являются репрезентативными по крайней мере 2 индивидуальных экспериментов с минимумом n = 4 и представлены как среднее ± SEM, ns = не значимо, * p <0.05, ** p <0,01. (L) Данные о выживаемости из C57Bl / 6 (квадраты, n = 7) и AMCase - / - (треугольники, n = 7). Данные являются репрезентативными для 4 отдельных экспериментов с C57Bl / 6 (n> 40) и AMCase — / — (n = 40), их значимость проверена с использованием логарифмического ранга (Mantel-Cox) и критерия Гехана-Бреслоу Вилкоксана * p <0,05.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002990.g006

Обсуждение

Хронические инфекции представляют собой непрерывную битву между иммунной системой хозяина и репликацией патогена.Многие простейшие паразиты и грибковые патогены развили стадию жизненного цикла цисты, которая обеспечивает ей повышенную защиту от деградации окружающей среды, а также от эндогенных механизмов атаки хозяина [72] — [74]. В случае токсоплазмы эти кисты преимущественно обнаруживаются в иммунно-защищенном мозге, что затрудняет выведение паразита и приводит к пожизненной инфекции. Здесь мы описываем три новых открытия: 1) несмотря на доминирующий иммунный ответ Th2 во время инфекции Toxoplasma, в инфицированном мозге существует популяция макрофагов, которые демонстрируют отчетливый альтернативно активированный фенотип; 2) эти клетки ответственны за зависимый от хитиназы лизис цист Toxoplasma и 3) эта хитиназная активность обеспечивается за счет продукции AMCase, которая необходима для защитных иммунных ответов.

Множественные исследования продемонстрировали роль CXCR3 и его лигандов в миграции активированных Т-клеток во время иммунных ответов Th2, в том числе к участкам инфекции [75], [76]. Также известно, что хемокины CXCL9 и CXCL10 индуцируются присутствием провоспалительного цитокина IFN-γ [34], [36], [37], [77]. Позже, однако, функция этого семейства хемокинов расширилась, включив передачу нейроглиальных сигналов после поражения мозга, когда поврежденные нейроны активируют CXCL10 и привлекают экспрессирующую CXCR3 микроглию для фагоцитоза денервированных дендритов [33].В соответствии с этим, другое недавнее исследование включило CXCR3 в функцию периваскулярных макрофагов и их способность ремоделировать сосудистую сеть во время стресса [78]. Мы отметили активацию CXCR3, CXCL9 и CXCL10 в головном мозге во время хронической инфекции токсоплазмы. Кроме того, CXCR3 предпочтительно экспрессировался на макрофагах, экспрессирующих рецепторы скавенджеров MMR и стабилизин-1, что указывает на альтернативно активированный фенотип для этих клеток. Предыдущие исследования установили важные функции AAMØ в контексте гельминтозов и заживления ран [43], [79], [80], но не во время инфекции, которая генерирует такой поляризованный иммунный ответ Th2, как Toxoplasma. T. gondii , как известно, использует метаболический путь аргинина и индуцирует экспрессию аргиназы-1 в макрофагах, подавляя, таким образом, продукцию оксида азота, но это не приводит к альтернативной активации этих клеток [46] — [48]. Вместо этого наши данные указывают на роль кисты как источника альтернативной активации макрофагов и последующей способности этих клеток лизировать кисты за счет разрушения хитина в стенке кисты. Таким образом, мы наблюдали контактно-зависимое значительное увеличение активности аргиназы после лечения кистами и cystAg, предполагая, что эта индукция не является результатом инфекции реплицирующимся паразитом, а, скорее, наличием хитина в стенке кисты.Наблюдаемая слабая индукция активности аргиназы также указывает на ограниченную роль аргиназы-1 в хитин-индуцированном фенотипе.

Хитин обнаружен в экзоскелетах насекомых, клеточных стенках грибов, оболочках паразитических нематод и является компонентом стенки цисты T. gondii [49], [50]. Присутствие этой экзогенной молекулы может вызывать рекрутирование AAMØ, базофилов, нейтрофилов и эозинофилов [52], [81] — [84]. Активные хитиназы, такие как AMCase и хитотриозидаза, секретируются макрофагами в ответ на хитинсодержащие патогены и, как было показано, ингибируют рост гиф хитиновых грибов, таких как Candida и Aspergillus [56], [58].Несмотря на связь между хитином и активизацией воспаления 2 типа в легких [52], недавнее исследование не продемонстрировало никакой роли AMCase в возникновении аллергической патологии дыхательных путей [85]. В этом исследовании мы впервые демонстрируем активность хитиназы макрофагов в ответ на простейшие патогены. Считается, что распознавание хитина зависит от размера и включает комбинацию TLR2 и рецепторов скавенджеров, таких как MMR и dectin-1 [49], [58]. Здесь мы продемонстрировали присутствие таких рецепторов-поглотителей в ассоциации с кистами, и это будет представлять интерес в будущих исследованиях, чтобы определить роль этих молекул в локализации кисты во время инфекции токсоплазмой.Независимо от задействованных рецепторов, вероятно, что это контактно-зависимый процесс, и действительно, цисты были неспособны индуцировать продукцию мочевины или активность хитиназы в макрофагах при разделении мембранами из лунок. Кроме того, анализ местоположения клеток, продуцирующих AMCase, в головном мозге обнаруживает, что они надежно близки к кистам и часто находятся в прямом контакте с реактивирующимися или разрушающимися кистами. Эти изображения показывают, что, несмотря на присутствие многих DAPI-положительных клеток, окружающих структуру кисты, выход паразитов через стенку кисты происходит параллельно с активностью макрофагов или AMCase.Наши данные предполагают, что присутствие антигенов кисты индуцирует альтернативную активацию макрофагов и что эти антигены необходимы макрофагам для выработки хитиназы даже в присутствии IL-4. Таким образом, альтернативной активации макрофагов недостаточно для продукции AMCase и активности хитиназы. Значительное увеличение неферментативно активной хитиназоподобной молекулы YM-1 в инфицированном мозге согласуется с предыдущими сообщениями о совместной экспрессии AMCase и YM-1 в макрофагах, а не в эпителиальных клетках [63].

Live imaging in vitro продемонстрировал AMCase-зависимую деградацию цист, как показано с использованием как ингибитора хитиназы, так и AMCase — / — макрофагов. Хотя нет никаких доказательств того, что активная хитиназа продуцируется T. gondii (ToxoDB), аналогичное время выживания кист, наблюдаемое для AMCase-нулевых макрофагов и макрофагов, ингибированных хитиназой, исключает возможность того, что брадизоиты являются источником ферментативной активности и разрушаются. из кисты. Хитин-зависимая индукция активности хитиназы подразумевает, что макрофаги имеют доступ к хитину в стенке кисты до опосредованного хитиназой разрушения кисты.Преобладающая точка зрения из исследований ультраструктуры заключается в том, что кисты остаются внутриклеточными внутри нейронов [15], [86], [87] ( A. Koshy и J. Boothroyd, личное сообщение ), но анализ нагрузки кисты с течением времени показывает уменьшение количества кист. подразумевая наличие некой формы эффекторного механизма [16]. Несколько исследований продемонстрировали перфорин-зависимый контроль бремени кист во время хронической инфекции [17], [18]. Мы предполагаем, что вместо прямого воздействия перфорина на кисты, наиболее вероятно, что продукция перфорина CD8 + Т-клетками может инициировать этот процесс, лизируя инфицированную кисту клетку, тем самым подвергая стенку кисты хитиназной активности макрофагов.Эта модель могла бы объяснить многие наблюдения макрофагов в тесной связи с разрывными кистами [8], [17], [19]. Следует отметить, что мы обнаружили, что макрофаги BALB / c, которые более легко активируются альтернативно, имели повышенную активность лизиса кист по сравнению с C57Bl / 6 (Рисунок S7). Это может быть одним из объяснений повышенной устойчивости к токсоплазматическому энцефалиту у мышей BALB / c [30], [88].

Хотя активность AMCase не требуется для защитного иммунитета во время острой инфекции, она необходима для защиты во время хронической стадии инфекции.Наши наблюдения за увеличением количества кист и бремени паразитов, а также снижения выживаемости у AMCase-нулевых мышей указывают на особую и важную роль опосредованного хитиназой лизиса кист в головном мозге. Таким образом, внутри мозга сдерживание кисты кажется таким же важным, как уничтожение свободных паразитов в борьбе с патологией. Кроме того, непрерывная хитин-опосредованная атака макрофагов и высвобождение паразитов из латентных кист будет постоянным источником антигенной стимуляции иммунного ответа.Это последнее открытие может дать объяснение непрерывному привлечению Т-клеток в мозг.

В течение некоторого времени было очевидно, что количество кист в головном мозге можно контролировать эндогенно, однако идентификация точных эффекторных механизмов не была столь очевидной. В этих исследованиях мы демонстрируем наличие особой популяции макрофагов в головном мозге во время хронической токсоплазменной инфекции, которые экспрессируют CXCR3, MMR, стабилин-1 и аргиназу-1. Кроме того, эти макрофаги обладают хитиназной активностью, локализуются в кистах и ​​наблюдаются в связи с деградацией кист.Механизм лизиса кисты зависит от AMCase, и этот фермент необходим для выживания во время хронической инфекции, чтобы уменьшить количество паразитов. Постоянное присутствие токсоплазматических кист в головном мозге и других тканях представляет постоянную угрозу реактивации для пациента с ослабленным иммунитетом. Механизмы, которые улучшают удаление кист или предотвращают их реактивацию во время токсоплазмы или других простейших инфекций, могли бы предоставить новую линию антипаразитарных методов лечения.

Методы

Заявление об этике

Эксперименты в этом исследовании были выполнены в строгом соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здоровья.Протоколы были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Калифорнийского университета в Риверсайде. В ходе этих исследований были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных.

Мыши и паразиты

T. gondii Штаммы Pruigniund и RH поддерживали in vitro и , как описано ранее [89]. Растворимый антиген токсоплазмы (sTAg) получали из тахизоитов штамма RH, как описано ранее [90]. Штамм Pruigniud был использован для in vitro инфекций тахизоитом в соотношении 3–1.Штамм Me49 T. gondii поддерживали у инфицированных мышей Swiss Webster и CBA / CaJ. Для заражения мозг инфицированных мышей удаляли, помещали в 3 мл стерильного 1 × PBS и пропускали 3-5 раз через иглу калибра 18,5, а затем через иглу калибра 20,5 и 22,5. Количество цист в аликвоте 30 мкл определяли микроскопически. Суспензии головного мозга доводили до 100 цист / мл, и мышей инфицировали каждой по 20 цист внутрибрюшинно. Исследования инфекции мышей с нулевым C57Bl / 6 и AMCase проводились по крайней мере четыре раза с минимум 7 биологическими контролями.Мышей C57Bl / 6, CBA / CaJ (Джексон, Бар-Харбор, Мэн) и мышей Swiss Webster (Charles River, Wilmington, MA) содержали в среде, свободной от патогенов, в соответствии с установленными протоколами IACUC в Калифорнийском университете в Риверсайде. AMCase-нулевые мыши были получены путем нацеливания на экзон 5 с использованием рекомбинации loxP / CRE, как описано ранее [85]. Мыши с удаленным геном AMCase имели смешанный фон, C57BL / 6NTac: 129SvEvBrd, и были скрещены с C57 / BL6 в течение по меньшей мере 10 поколений. Эти мыши были созданы и содержались в соответствии с протоколами IACUC, установленными Pfizer.

Приготовление суспензий спленоцитов и мононуклеарных клеток головного мозга (BMNC)

Суспензию отдельных клеток из селезенки получали путем пропускания через нейлоновый фильтр для клеток 40 мкм (BD, San Jose, CA). Суспензии промывали полным RPMI (10% FCS, 1% пенницилин / стрептомицин, 1% глутамин, 1% пирувата натрия, 1% заменимых аминокислот, 0,1% B-меркаптоэтанола) (Life Technologies, Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк) и центрифугировали в течение 5 минут при 1200 об / мин при 4 ° C. Красные кровяные тельца лизировали с использованием 0.86% раствор хлорида аммония, центрифугирование и ресуспендирование в RPMI завершено. BMNC получали, как описано ранее [89].

Проточная цитометрия

BMNC или клетки селезенки инкубировали с различными конъюгированными антителами против CXCR3, CD3, CD4, CD8, CD11b, IL-10 и CD45 (eBioscience, Сан-Диего, Калифорния) и MMR (Biolegend, Сан-Диего, Калифорния). Клетки анализировали с использованием проточного цитометра BD FACSCanto II (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) и программного обеспечения для анализа FlowJo v.8.7.3 (Treestar Software, Ashland, OR).Популяции клеток определяли путем стробирования по CD4 +, CD8 +, CD45 ^hi / CD11b + (макрофаги) и CD45 ^int / CD11b + (микроглия) из ворот живых клеток.

Количественная ПЦР с обратной транскрипцией (qRT-PCR)

из образцов ткани мозга экстрагировали реагентом TRIzol (Life Technologies, Grand Island, NY) в соответствии с инструкциями производителя. Обработку ДНКазой1 и синтез первой цепи кДНК проводили с использованием набора для синтеза кДНК (BioRad, Hercules, CA) в соответствии с инструкциями производителя.Специфические праймеры CXCR3, CXCL9, CXCL10, CCL2, CCL5, AMCase, Arg1 и Chit1 для ПЦР в реальном времени были приобретены у компании IDT primer Quest (http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest/). Последовательности праймеров были следующими: CXCR3, прямой, 5′-TGTAGCCCTCACCTGCATAGTTGT-3 ‘; обратный, 5’-GTTGTACTGGCAATGGGTGGCATT-3 ‘, CXCL9, прямой, 5′-TCAGATCTGGGCAAGTGTCCCTTT-3′; обратный, 5’-TTTGGTGACGTGAGCCTCAGAAGT-3 ‘, CXCL10, прямой, 5′-TGGCTAGTCCTAATTGCCCTTGGT-3′; обратный, 5’-TCAGGACCATGGCTTGACCATCAT-3 ‘, CCL2 прямой, 5′-TCACCTGCTGCTACTCATTCA-3′; обратный, 5’-TACAGCTTCTTTGGGACACCT-3 ‘, CCL5 прямой, 5′-TCGTGCCCACGTCAAGGAGTA-3′; обратный, 5’-TCTTCTCTGGGTTGGCACACA-3 ‘, AMCase прямой, 5′-TTTCCACTTCTCAGAACCGCC-3′; обратный, 5’-TGTTGCTCTCAATAGCCTCCT-3 ‘, CHIT1 прямой, 5′-AGTTCGGTTCTTTCCCAGGGA-3′; обратный, 5’-GCTGATGGTTGTCCATTCCAG -3 ‘, Arg1 вперед, 5′-TGGCTTTAACCTTGGCTTGCT-3′; обратный, 5’-AAAGAACAAGCCCTTGGGAGG-3 ‘, SAG1 вперед, 5′-CGACAGCCGCGGTCATTCTC-3′; обратный, 5’-GCAACCAGTCAGCGTCGTCC-3 ‘, SAG4 прямой, 5′-CTGCTTTCGTCTGTCTTCAAC-3′; обратный, 5’-CTTCTTCACTGGCAATGAACTC-3 ‘, MAG1 вперед, 5′-TGAGAACTCAGAGGACGTTGC-3’; обратный, TCTGACTCAAGCTCGTCTGCT-3 ‘Ym1 вперед, 5′-CCTGCCTGTGTACTCACCTG-3′; обратный, 5’-AGCCTTGGAATGTCTTTCTCCA-3 ‘; Ym2 вперед, 5’-CCTGCCTGTGTACTCACCTG-3 ‘; обратный, 5’-CAGCCTTGGAATGTGGTTCA-3 ‘; RELM-α вперед, 5’-GTCAGCAATCCCATGGCGTA-3 ‘; обратный, 5’-GGCCCATCTGTTCATAGTCTTG-3 ‘; BRP-39 вперед, 5’-TTACCAGACGCCATCCAACC-3 ‘; обратный, 5’-ATAAGAACGCAGGAACGGGG-3 ‘; IL-4Rα вперед, 5’-AGCCAGGACTGGGACTAGAG-3 ‘; обратный, 5’-CCTCGAGGTATCGCCTTGAC-3 ‘; ИЛ-4 вперед, 5’-CCATATCCACGGATGCGACA-3 ‘; обратный, 5’-AAGCCCGAAAGAGTCTCTGC-3 ‘.ПЦР в реальном времени выполняли с использованием системы обнаружения ПЦР в реальном времени iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA) в сумме 25 мкл реакционной смеси с 12,5 мкл основной смеси для qPCR SYBR Green (2 ×) (Bio-Rad, Hercules, CA ) и праймер 300 нМ. Условия реакции были следующими: 10 мин при 95 ° C, затем 40 циклов по 15 с при 95 ° C и 60 с при 60 ° C. Прямой праймер HPRT (гипоксин фосфорибозилтрансфераза ) (5′-CCCTCTGGTAGATTGTCGCTTA-3 ‘) и обратный праймер (5′-AGATGCTGTTACTGATAGGAAATTGA -3’) использовали в качестве эндогенного контроля.Количественные результаты представляют собой кратность индукции экспрессии целевого гена в разные дни после заражения по сравнению с экспрессией целевого гена в наивных образцах кДНК. Анализ на 1,5% агарозных гелях выполняли для исключения неспецифической амплификации. NTC, контроль без матрицы (только реагент без матрицы) был включен в каждый анализ для обнаружения любого возможного загрязнения реагентов ПЦР.

Иммуногистохимия

Сразу после иссечения мозг делали пополам сагитально и мгновенно замораживали в холодном изопентане.Затем замороженные мозги помещали в стандартный криомолд Tissue-Tek, заполняли раствором для оптимальной температуры резки (OCT) (Tissue-Tek, Torrance, CA) и помещали на сухой лед, а затем хранили при -80 ° C. Последовательные срезы 10–20 мкм готовили на стандартном криостате (LEICA / CM1850, Simi Valley, CA). Замороженные срезы ткани фиксировали 75% ацетона / 25% этанола, затем блокировали 10% ослиной сывороткой перед инкубацией с очищенными антителами. Очищенные первичные антитела к Iba-1 (Вако, Ричмонд, Вирджиния), CXCR3 (Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк), MMR (AbD Serotec, Роли, Северная Каролина), аргиназе-1, AMCase и стабилину-1 (Santa Cruz Biotechnology, Санта Круз, Калифорния), а также биотинилированный лектин томатов (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) инкубировали с образцами тканей в течение 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° C, а затем с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с Alexa 488, Alexa 568 или Alexa 647 в концентрации 2 мкг / мл (Life Technologies, Grand Island, Нью-Йорк). Образцы помещали в Prolong Gold с DAPI (Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк) для ядерного контрастного окрашивания. Изображения были собраны на сканирующем конфокол-микроскопе Leica SP2 (Leica Optics, Германия) и проанализированы с использованием Improvision Volocity 5.0 (Perkin-Elmer, Waltham, MA).Расстояние между клетками и кистами рассчитывали по конфокальным изображениям не менее 12 кист и не менее 6 экспрессирующих AMCase клеток на кисту.

Количественная оценка бремени

 @article {6962430,
  abstract = {{Образование цист, неотъемлемая часть жизненного цикла многих свободноживущих простейших, позволяет этим организмам выживать в неблагоприятных условиях окружающей среды.Учитывая преобладание свободноживущих простейших в окружающей среде, связанной с пищевыми продуктами, предполагается, что эти организмы играют важную, но в настоящее время недостаточно изученную роль в эпидемиологии патогенных бактерий пищевого происхождения. Выживание внутрикистозных бактерий очень важно, так как это позволит бактериям выжить при строгих мерах по очистке и дезинфекции, применяемых в окружающей среде, связанной с пищевыми продуктами. Настоящее исследование показывает, что штаммы широко распространенных и важных бактерий пищевого происхождения (Salmonella enterica, Escherichia coli, Yersinia enterocolitica и Listeria monocytogenes) выживают внутри цист повсеместно распространенной амебы Acanthamoeba castellanii даже при воздействии антибиотиками (100 мкг / мл гентамицина). ) или в сильно кислых условиях (pH 0.2) и возобновить активный рост в среде бульона после эксцистирования. Наблюдались штаммовые и видоспецифичные различия в сроках выживания, при этом Salmonella enterica выживала до 3 недель внутри амебных цист. До 53% кист были инфицированы патогенными бактериями, которые располагались в цитозоле кисты. Наше исследование предполагает, что роль свободноживущих простейших и особенно их цист в сохранении и эпидемиологии пищевых бактериальных патогенов в окружающей среде, связанной с пищевыми продуктами, может быть гораздо более важной, чем предполагалось до сих пор.}},
  author = {{Ламбрехт, Эллен и Баре, Жюли и Шават, Наташа и Берт, Вим и Саббе, Коэн и Хоуф, Курт}},
  issn = {{0099-2240}},
  journal = {{ПРИКЛАДНАЯ И ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ}},
  ключевые слова = {{ACANTHAMOEBA-CASTELLANII, FREE-LIVING PROTOZOA, LEGIONELLA-PNEUMOPHILA, CAMPYLOBACTER-JEJUNI, РАЗНООБРАЗИЕ, ПОЛИФАГА, СОПРОТИВЛЕНИЕ, КУЛЬТУРА, ЗДОРОВЬЕ, ТРОФОЗОИТЫ}},
  language = {{eng}},
  число = {{16}},
  pages = {{5604-5612}},
  title = {{Кисты простейших служат нишей для выживания и защитным укрытием для патогенных бактерий пищевого происхождения}},
  url = {{http: // dx.doi.org/10.1128/AEM.01031-15}},
  объем = {{81}},
  год = {{2015}},
}

 

Киста относится к стадии покоя простейших, которая позволяет им выживать в неблагоприятных условиях окружающей среды.Следовательно, киста — это состояние передачи простейших. По этой причине киста заразна. Процесс образования кисты обозначен как encystation . Поскольку энцистация происходит в прямой кишке хозяина, цисты могут быть идентифицированы в кале. Цисты — это сферические структуры, которые меньше трофозоитов. Они покрыты твердой стенкой кисты в два слоя. В молодых кистах видны сократительная вакуоль, макронуклеус и реснички. Структуры органелл старых кист зернистые.В кистах задерживаются метаболизм и моторика. Киста Entamoeba histolytica показана на рисунке 1 .

Рисунок 1: Entamoeba histolytica Циста

Кисты также встречаются у бактерий и нематод. У бактерий цисты менее устойчивы, чем споры. Они позволяют бактериям распространяться. Они прорастают в благоприятных условиях окружающей среды. Цисты возникают у нематод, паразитирующих на растениях, как часть их жизненного цикла.

Что такое трофозоит

Трофозоит относится к стадии роста паразитических простейших, которые поглощают питательные вещества от хозяина.Образование трофозоита из кисты обозначается как эксцистация . Эксцистанция происходит в толстом кишечнике хозяина при последующем проглатывании кисты хозяином. Трофозоиты не являются стойкими структурами. Обычно трофозоиты покрыты ресничками. Следовательно, они подвижны. Они проявляют вращательную или сверлящую моторику. Трофозоит Entamoeba histolytica показан на рис. 2 .

Рисунок 2: Entamoeba histolytica Трофозоит

Трофозоиты содержат два хорошо заметных ядра.Макронуклеус имеет форму почки, а микроядро — сферическое. Трофозоиты состоят из отверстия на переднем конце. Он известен как перистом. Помимо питания, размножение простейших происходит на стадии трофозоитов либо половым путем путем конъюгации, либо бесполым путем бинарного деления. Самый крупный паразитический простейший в организме человека — это Balantidium coli.

Сходства между цистой и трофозоитом

• Циста и трофозоит — две стадии жизненного цикла простейших.
• И циста, и трофозоит одноклеточные.
• И циста, и трофозоит состоят из видимых ядер.
• И циста, и трофозоит содержат сократительные вакуоли.
• И циста, и трофозоит можно найти в кале инфицированных людей.

Разница между цистой и трофозоитом

Определение

Киста: Киста относится к стадии покоя простейших, которая помогает выжить в неблагоприятных условиях окружающей среды.

Трофозоит: Трофозоит относится к стадии роста паразитических простейших, которые поглощают питательные вещества от хозяина.

Формация

Киста: Киста образуется в процессе, называемом энцистацией.

Трофозоит: Трофозоит образуется в процессе, называемом эксцистанцией.

Тип

Киста: Киста — это стадия покоя простейших.

Трофозоит: Трофозоит — активная репродуктивная стадия простейших.

Этап

Киста: Кисты — это состояние передачи простейших.

Трофозоит: Трофозоиты являются болезнетворным состоянием простейших.

Форма

Киста: Киста сферической формы.

Трофозоит: Трофозоит овальной формы с заостренным концом.

Размер

Киста: Киста диаметром 40-60 мкм.

Трофозоит: Трофозоит имеет длину 50-130 мкм и ширину 20-70 мкм.

Поверхность

Киста: Киста покрыта толстой твердой стенкой.

Трофозоит: Поверхность трофозоита покрыта ресничками.

Подвижность

Киста: Кисты неподвижны.

Трофозоит: Трофозоиты проявляют вращательную или сверлящую подвижность.

Инфекция

Киста: Киста инфекционная.

Трофозоит: Трофозоиты неинфекционны.

Репродукция

Киста: Кисты не репродуктивные структуры.

Трофозоит: Трофозоиты воспроизводятся посредством двойного деления.

Ядра

Киста: Кисты содержат одно макронуклеус в форме почки.

Трофозоит: Трофозоиты содержат макроядро почковидной формы и микроядро сферической формы.

Важные клеточные структуры

Киста: Киста содержит сократительную вакуоль и клеточную стенку с двумя слоями.

Трофозоит: Трофозоиты содержат воронкообразный цитостом и две сократительные вакуоли.

Сопротивление

Киста: Киста устойчива к воде и высыханию.

Трофозоит: Трофозоиты состоят из прочной клеточной мембраны и не являются резистентными структурами.

Выживание вне хозяина

Киста: Кисты могут выжить вне организма-хозяина.