Пирамид таблетки от чего: Пирамил — инструкция по применению, дозы, побочные действия, противопоказания, цена, где купить

Что такое экстази?

Что такое экстази?

Экстази, также известный как «Молли», представляет собой синтетический наркотик, известный прежде всего своими галлюциногенными и стимулирующими эффектами. Известно, что он передает чувства повышенной энергии, удовольствия, эмоциональной теплоты и искажает сенсорное восприятие и восприятие времени.

Химическое название экстази — 3,4-метилендиоксиметамфетамин (МДМА). Это производное амфетамина и имеет структуру, аналогичную метамфетамину («мет»).

Некоторые из самых ярких сленговых терминов, используемых для обозначения экстази (МДМА), основанные на названии препарата, его эффектах и ​​внешнем виде, включают:

• Адам
• Фасоль
• Конфеты
• Ясность
• E
• Сущность
• Счастливая таблетка
• Hug Drug
• Молли
• Закуски Скуби
• Скорость любовника
• X
• XTC

Первоначально экстази использовали в основном в ночных клубах и на рейвах, но теперь его употребление распространилось на более широкий круг людей.

Признаки употребления экстази

По данным Национального института по борьбе со злоупотреблением наркотиками, МДМА вызывает ряд эффектов, в том числе:

• Беспокойство
• Проблемы с вниманием
• Путаница
• Снижение либидо
• Депрессия
• Импульсивность
• Бессонница
• Раздражительность
• Проблемы с памятью
• Пониженный аппетит

Эффект от МДМА обычно длится от трех до шести часов.

Типы экстази

«Экстази» обычно принимают в форме таблеток или капсул, но его также можно глотать в виде жидкости или вдыхать в виде порошка.

• Таблетки : «Экстази» обычно выпускается в форме таблеток, на которые часто наносят графический рисунок или коммерческие логотипы.
• Порошок : Экстази, известный под популярным прозвищем Молли (на жаргоне «молекулярный»), часто используется для предположительно «чистой» кристаллической порошковой формы МДМА.Однако, по данным Национального института по борьбе со злоупотреблением наркотиками, Молли часто сочетают с другими веществами, такими как синтетический катинон (соли для ванн).

В отличие от других рекреационных наркотиков, таких как кокаин и никотин, которые получают из растений, экстази синтезируется путем изменения структуры молекулы амфетамина. Из-за способа его изготовления его чистота может существенно различаться, а другие соединения можно легко объединить в одну таблетку. Добавки и загрязнители экстази часто включают метамфетамин, кофеин, эфедрин и кетамин.

использует

Хотя сегодня экстази известен в основном как рекреационный наркотик, он также использовался не по назначению в медицинских целях. Вкратце, экстази рассматривали как терапевтическое средство, поскольку некоторые психотерапевты полагали, что он открывает людям и повышает их потенциал сочувствия и понимания друг друга.

Это использование было прервано криминализацией МДМА. Мнение о том, что экстаз может надежно усилить терапевтический процесс, в настоящее время вышло из употребления в психотерапевтическом сообществе.

Экстази был классифицирован как наркотик Списка I в 1985 году, что означает, что это вещество имеет высокий потенциал злоупотребления и не используется для лечения заболеваний.

Воздействие экстази

Экстази действует, влияя на активность трех химических веществ в мозге: дофамина, норадреналина и серотонина. Эти химические вещества играют роль в различных функциях организма, включая уровни энергии, настроение, эмоции и сон.

Немедленное воздействие экстази начинается примерно через 45 минут после приема дозы.Люди обычно испытывают повышенное чувство благополучия и эмоциональной теплоты. Другие эффекты включают в себя большее сочувствие к другим и улучшенное сенсорное восприятие.

Риски

Хотя люди, употребляющие экстази, испытывают повышенное чувство эйфории и бдительности, прием препарата также имеет ряд неблагоприятных последствий, включая:

• Неорганизованные мысли
• Чувство отстраненности
• Повышенная тревожность
• Учащение пульса
• Раздражительность
• Тошнота
• Плохой аппетит
• Потоотделение и приливы

Передозировка случается редко, но может быть опасной для жизни.Симптомы передозировки экстази могут включать обморок, панические атаки или крайнее беспокойство, высокое кровяное давление и судороги. Когда после употребления экстази следует интенсивная физическая активность, это может привести к потенциально опасному повышению температуры тела, известному как гипертермия.

Еще одна серьезная опасность заключается в том, что люди, принимающие экстази, на самом деле не знают, что они на самом деле принимают. В одном исследовании исследователи обнаружили, что только 60% протестированных образцов вообще содержали какой-либо МДМА, а многие были смешаны с так называемым «поддельным кокаином».«Почти в 25% образцов исследователи не смогли определить, что на самом деле было в таблетках.

История экстази

Первоначально МДМА был разработан в 1912 году как фармацевтическое соединение, которое можно было использовать в производстве других фармацевтических препаратов, и он был запатентован в 1914 году. Но как только были обнаружены галлюциногенные свойства препарата, его дальнейшая разработка была остановлена ​​на несколько десятилетий.

Спустя десятилетия «экстази» был одним из нескольких наркотиков, испытанных в военных целях.Затем он был повторно синтезирован сначала Гордоном Аллесом, затем Александром Шульгиным, который проверил его на себе, своей жене и своих друзьях. Шульгин продолжил разработку ряда новых соединений с различными эффектами и рисками, включая МДМА и ПММА (параметоксиметамфетамин), многие из которых оказались разновидностями уличного экстази. Спустя много лет после этого МДМА в конечном итоге появился на улицах как рекреационный наркотик.

МДМА, более ранняя версия экстази, стал популярным в качестве рекреационного наркотика в 1960-х и 1970-х годах.В 1980-х годах МДМА стал модным в качестве наркотика для вечеринок в ночных клубах и на рэйв-сцене, и его употребление возросло среди студентов колледжей, «яппи» и в гей-сообществе.

Однако из-за опасений по поводу рисков для здоровья, связанных с экстази, в 1977 году он был объявлен незаконным в Соединенном Королевстве, намного опередив его популярность в этой стране. Он был объявлен незаконным в Соединенных Штатах в 1985 году, когда Управление по борьбе с наркотиками (DEA) классифицировало его как препарат Списка I в соответствии с Законом о контролируемых веществах.

В течение нескольких лет в попытке обойти закон были синтезированы различные версии экстази, которые легли в основу движения дизайнерских наркотиков. Это производство было в конечном итоге объявлено вне закона, но вновь возникло как проблема примерно в 2000 году из-за популярности самодельного кристаллического метамфетамина.

фактов о психоактивном наркотическом экстази (МДМА)

Экстази — уличное название химического 3,4-метилендиоксиметамфетамина, сокращенно МДМА — это синтетический психоактивный (изменяющий сознание) наркотик с галлюциногенными и амфетаминоподобными свойствами.Его химическая структура похожа на два других синтетических наркотика, DA и метамфетамин, которые, как известно, вызывают повреждение мозга.

Что такое экстази?

Первоначально экстази был разработан как диетическая помощь, но также использовался экспериментально во время консультирования из-за его способности снижать запреты. Препарат также известен под многочисленными уличными названиями, включая: Молли, Адам, Xtc, X, Hug, Go, Hug Drug, Beans и Love Drug.

Хотя были обнаружены некоторые подпольные лаборатории, работающие в Соединенных Штатах, большая часть МДМА продается в США.S. производится в Канаде и ввозится контрабандой в США. Небольшой процент экстази в США производится в Нидерландах.

Используйте

Экстази выпускается в форме таблеток, на которые часто наносят графические изображения или коммерческие логотипы. Его обычно глотают в виде таблеток, но его также можно раздавить и вдыхать, вводить путем инъекции или использовать в форме суппозитория.

Экстази популярен среди подростков среднего класса и молодежи. Его продают в барах, подпольных ночных клубах и на рейвах, где проходят ночные вечеринки.

Эффекты

Экстази известен своим возбуждающим действием, а также искажениями во времени и восприятии, а также усилением удовольствия от физических переживаний. Эффект длится от трех до четырех часов за одно использование. Физические побочные эффекты, возникающие при приеме экстази, могут длиться неделями.

Его популярность выросла в конце 1980-х годов на рэйв-сценах и в клубах, а также в университетских городках из-за его репутации источника энергии, а также доверия и открытости среди тех, кто его принимает.

Опасности

Экстази может вызвать некоторые проблемы, подобные тем, которые встречаются у людей, употребляющих амфетамин и кокаин. Непосредственные эффекты могут включать:

• Агрессия
• Беспокойство
• Импульсивность
• Раздражительность
• Отсутствие аппетита
• Панические атаки
• Снижение интереса и удовольствия от секса
• Беспокойство
• Печаль
• Значительное снижение умственных способностей
• Нарушения сна
• Жажда

Последствия приема препарата для здоровья могут включать:

• Затуманенное зрение
• Сердечные аритмии
• Озноб
• Обезвоживание
• Сердечная недостаточность
• Высокое кровяное давление
• Гипертермия (выраженное повышение температуры тела)
• Непроизвольное сжимание челюсти и скрежетание зубами
• Почечная недостаточность
• Потеря сознания
• Спазмы в мышцах
• Тошнота
• Изъятия
• Потоотделение

Люди, употребляющие экстази, часто испытывают мышечное напряжение, непроизвольное стискивание зубов, тошноту, помутнение зрения, быстрое движение глаз, обморок, озноб или потливость.

Эти медицинские последствия могут быть серьезными и потенциально опасными для жизни. МДМА очень опасен, если вы живете с заболеваниями системы кровообращения или сердца, поскольку препарат увеличивает частоту сердечных сокращений и артериальное давление.

Наркомания

Почти 60% людей, употребляющих МДМА, сообщают о симптомах отмены, включая усталость, потерю аппетита, подавленность и проблемы с концентрацией внимания. Некоторым людям, употребляющим экстази, потребуется лечение от наркотиков.

Общие добавки

По данным Управления по борьбе с наркотиками (DEA), во многих таблетках экстази, изъятых сотрудниками правоохранительных органов, были обнаружены другие наркотики или комбинация наркотиков, которые могут быть вредными.МДМА часто смешивают с другими лекарствами, такими как:

• Кофеин
• Кокаин
• Декстрометорфан или ДХМ (средство от кашля, которое в высоких дозах оказывает действие, подобное PCP)
• Эфедрин (стимулятор)
• Кетамин (анестетик, используемый в основном ветеринарами, который также имеет действие, подобное PCP)
• Метамфетамин

Сочетание или употребление наркотиков с МДМА, включая марихуану и алкоголь, опасно и подвергает вас более высокому физическому риску.Взаимодействие с другими людьми

Нейротоксичность

В исследовании, проведенном на обезьянах, воздействие экстази в течение четырех дней вызвало повреждение серотониновых нервных окончаний мозга, которое можно было увидеть даже через семь лет, что свидетельствует о том, что люди, принимающие экстази, могут подвергаться риску необратимого повреждения мозга.

Исследования показали, что МДМА может повредить серотонин-содержащие нейроны, что может привести к длительным изменениям настроения, а также потенциально повлиять на внимание, память и другие когнитивные функции.Взаимодействие с другими людьми

Наркотики, похожие на экстази

Материнским наркотиком экстази является МДА, амфетаминоподобный наркотик, имеющий аналогичную химическую структуру с МДМА. PMA (параметоксиамфетамин, связанный со смертельным исходом в США и Австралии) также иногда продается как MDMA. Мефедрон — также новый дизайнерский препарат с аналогичными эффектами.

13 распространенных наркотиков и их уличные названия

Названия лекарств могут различаться в зависимости от региона, штата и страны, в зависимости от того, с кем вы разговариваете, каждый наркотик может иметь несколько прозвищ или названий улиц — может быть почти трудно угнаться за ними всеми.

Злоупотребление наркотиками не всегда происходит открыто и чаще всего происходит втайне от друзей, семьи и коллег. Если кто-то из ваших знакомых может бороться с расстройством, вызванным злоупотреблением психоактивными веществами, или ему может угрожать передозировка, может стать важным знать, какие лекарства принимал ваш любимый человек. Ниже приводится список некоторых из самых популярных названий, которые можно использовать при обращении к этим распространенным незаконным наркотикам.

ТРИНАДЦАТЬ ОБЫЧНО ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРЕПАРАТЫ И ИХ СООТВЕТСТВУЮЩИЕ УЛИЦЫ

1. MDMA — Адам, Бин, Синие поцелуи, Конфеты, Ясность, Обувь для танцев, Диско-печенье, Голуби, Электронная бомба, Экстази, Яичные роллы, Ева, Наркотик для объятий, Наркотик любви, Малкольм, Малькольм-Икс, Мерседес Молли, жители Нью-Йорка, Skittles, Smartees, Thizz, X, XTC, гласные
2. Героин — Тетя Хейзел, Big H, Black Pearl, Black Tar, Brown Crystal / Tar, Brown Sugar, Chiba, China White, Chiva, Dope, Dragon, H., Nod, Tar, Scag, Scat Smack, White, White Lady
3. Кокаин — Badrock, Base, Ball, Baseball, Bazooka, Beat, Big Rush, Blanca, Blow, Brick, C., Cola, Crack, G-Rock, Happy Trails, Hardball, Haven Dust, Flake, Icing, Monster , Конфеты в носу, Рельс, Снег, Белоснежка, Тайник, Гудок, Белая пыль, Белый порошок, Yeyo
4. Метамфетамин — Amp, Blue Belly, Crank, Cris, Christy, Crystal, Crystal Meth, Ice, La Glass, Poor Man’s Coke, Tweak, White Crunch, Wash, White Cross
5. Alprazolam (Xanax) — бензо, синие футбольные мячи, доски, школьный автобус, Upjohn, белые мальчики, белые девушки, ксанни, ксанабары, желтые мальчики, Z-образные стержни, Zanbars
6. Cannabis -420, Blubbers, Blunt, Boom, Chronic, Dagga, Dope, Gangster, Ganja, Grass, Hash, Hashish, Hay, Herb, Joint, Marijuana, Mary Jane, Pot, Reefer, Skun, Skunk, Weed
7. LSD — Кислота, Пламя, Блоттер, Блоттер Кислота, Бумеры, Ура, Дозы, Точки, Вспышка, Хиты, Люси, Микроточка, Фиолетовая дымка, Пирамида, Табы, Поездки, Смайлы, Кубики сахара, Супермен, Звезды, Белое освещение , Оконное стекло, Yellow Sunshine
8. Кетамин — транквилизатор для кошек, кошачий валиум, зеленый, струйный, K, Kit Kat, фиолетовый, специальный K, Super C
9. Dextromethorphan — Dex, Drex, Orange Crush, Poor Man’s PCP, Red Devils, Red Hots, Robo, Rojo, Skittles, Triple C, Tussin, Velvet, бархатный сироп, витамин D
10. Фентанил — Apache, China Girl, China Town, China White, Dance Fever, Friend, Goodfella, Great Bear, He-Man, Jackpot, King Ivory, Murder 8, Perc-a-Pop, Poison, Tango & Cash
11. Гамма-гидроксимасляная кислота (GHB) — Blue Nitro, Caps, Cherry fX Bombs, Cherry Meth, Easy Lay, Everclear, Fantasy, Firewater, Gamma G, Gamma Hydrate, Georgia Homeboy, Grievous Bodily Harm, G-Riffic, Liquid Ecstasy, Liquid E, Liquid X, героин для бедняков, соленая вода, мыло, вода, Wolfies
12. Opium — A-Bomb, Aunti, Big O, Black, Buddha, Chandoo, Китайская патока, китайский табак, шоколад, Cruz, Dopium, Dreams, Easing Powder, Gee, Great Tobacco, Gum, Guma, O, O.П., Оспа, Ски, Зе, Ноль
13. Phencyclidine (PCP) — Angel Dust, Cliffhanger, Goon Dust, Happy Sticks, Бальзамирующая жидкость, Hog, Kools, Ozone, Peter Pan, Lethal Weapon, Rocket Fuel, Wack

Если вы обеспокоены тем, что ваш друг или любимый человек может бороться с употреблением наркотиков и зависимостью, знание названий некоторых из этих улиц может оказаться бесценным инструментом. Можно получить помощь, не достигнув «дна», и ARISE® Вмешательство по борьбе с наркотиками и алкоголем может помочь вашему другу или близкому человеку на пути к выздоровлению.

Фото-контролируемое высвобождение паклитаксела и модельных лекарств из пирамид РНК

Nano Res. Авторская рукопись; доступно в PMC 2019 30 июня.

Опубликован в окончательной отредактированной форме как:

PMCID: PMC6599617

NIHMSID: NIHMS1025231

Congcong Xu

¹ Center for RNA Отделение фармацевтики и фармацевтической химии, фармацевтический колледж; Исследовательский институт сердца и легких Дороти М. Дэвис, Медицинский колледж и Комплексный онкологический центр Джеймса, Государственный университет Огайо, Колумбус, Огайо, 43210, США

Хуэй Ли

¹ Центр нанобиотехнологии и наномедицины РНК; Отделение фармацевтики и фармацевтической химии, фармацевтический колледж; Дороти М.Исследовательский институт сердца и легких Дэвиса, Медицинский колледж и Комплексный онкологический центр Джеймса, Государственный университет Огайо, Колумбус, Огайо, 43210, США

Каймин Чжан

² Департаменты биоинженерии, микробиологии и иммунологии и Центр Джеймса Х. Кларка , Стэнфордский университет, Стэнфорд, Калифорния 94305, США

Дэниел Бинзель

¹ Центр нанобиотехнологии и наномедицины РНК; Отделение фармацевтики и фармацевтической химии, фармацевтический колледж; Дороти М.Исследовательский институт сердца и легких Дэвиса, Медицинский колледж и Комплексный онкологический центр Джеймса, Государственный университет Огайо, Колумбус, Огайо, 43210, США

Хонгран Инь

¹ Центр нанобиотехнологии и наномедицины РНК; Отделение фармацевтики и фармацевтической химии, фармацевтический колледж; Исследовательский институт сердца и легких Дороти М. Дэвис, Медицинский колледж и Комплексный онкологический центр Джеймса, Государственный университет Огайо, Колумбус, штат Огайо, 43210, США

Вах Чиу

² Департаменты биоинженерии, микробиологии и иммунологии, и Джеймс Х. .Центр Кларка, Стэнфордский университет, Стэнфорд, Калифорния 94305, США

³ SLAC Национальная ускорительная лаборатория, Стэнфордский университет, Менло-Парк, Калифорния 94025, США

Пейсуан Гуо

¹ Центр нанобиотехнологий и наномедицины РНК; Отделение фармацевтики и фармацевтической химии, фармацевтический колледж; Исследовательский институт сердца и легких Дороти М. Дэвис, Медицинский колледж и Комплексный онкологический центр Джеймса, Государственный университет Огайо, Колумбус, Огайо, 43210, США

¹ Центр нанобиотехнологии и наномедицины РНК; Отделение фармацевтики и фармацевтической химии, фармацевтический колледж; Дороти М.Научно-исследовательский институт сердца и легких Дэвиса, Медицинский колледж и Комплексный онкологический центр Джеймса, Государственный университет Огайо, Колумбус, Огайо, 43210, США

² Департаменты биоинженерии, микробиологии и иммунологии и Центр Джеймса Х. Кларка Стэнфордского университета, Стэнфорд, Калифорния 94305, США

³ SLAC Национальная ускорительная лаборатория, Стэнфордский университет, Менло-Парк, Калифорния 94025, США

Abstract

Стимулирующее высвобождение лекарств из наноносителя в условиях пространственного, временного и контролируемого дозирования представляет большой интерес в фармацевтической промышленности. Паклитаксел является одним из наиболее эффективных и популярных химиотерапевтических препаратов против ряда видов рака, таких как метастатический или неметастатический рак молочной железы, немелкоклеточный рак легких, рефрактерный рак яичников, связанная со СПИДом саркома Капоши и рак головы и шеи. Здесь, используя преимущества нанотехнологии РНК в биомедицине и материаловедении, мы разработали наноклетку для РНК в форме трехмерной пирамиды для фотоуправляемого высвобождения груза, используя паклитаксел в качестве модельного препарата.Запускаемое светом высвобождение паклитаксела или флуорофора Cy5 достигалось за счет включения фоторасщепляемых спейсеров в наночастицы РНК. При облучении ультрафиолетом грузы высвобождались быстро (в течение 5 мин). Обработка клеток рака груди in vitro наночастицами РНК, несущими фоторасщепляемый паклитаксел, показала более высокую цитотоксичность по сравнению с наночастицами РНК без фоторасщепляемого спейсера. Методология обеспечивает доказательство концепции применения контролируемого высвобождения лекарств из РНК-наноклеток с помощью светового триггера.

Ключевые слова: нанотехнология РНК, контролируемое высвобождение, паклитаксел, доставка лекарств, наночастицы РНК, трехсторонний переход Phi29

1. Введение

Интеллектуальные наноматериалы открыли новые горизонты для разработки все более эффективных и высокопроизводительных наноносителей через которую возможна выборочная доставка грузов [1]; такие материалы могут быть использованы в биомедицинских приложениях, особенно при разработке подходов к доставке, реагирующей на стимулы [2].Реализация этих передовых наноустройств требует простых манипуляций с биосовместимыми материалами в наномасштабе, чтобы сделать их восприимчивыми к определенному стимулу [3–6]. Хотя терапевтические препараты на основе наночастиц продемонстрировали преимущества в специфическом нацеливании на рак, высокая эффективность доставки остается проблемой из-за неспецифической фикианской диффузии терапевтических средств с наноносителей [7, 8]. Для достижения контролируемого высвобождения груза на платформах нанодоставки использовались различные стимулы, включая колебания температуры [9] и интенсивности ультразвука [10], изменения pH [11], окислительно-восстановительные градиенты [12] или свет [13, 14]. в чувствительных системах наночастиц.Среди внешних стимулов свет привлекает особое внимание из-за простоты производства, неинвазивного характера, контролируемой интенсивности и пространственно ограниченного применения для точно контролируемой продолжительности [15–19]. Таким образом, свет использовался в большом количестве приложений для интеллектуальных систем адресной доставки, которые могут обеспечивать контроль процессов лечения и обеспечивать транспортировку и высвобождение лекарств в очаги заболевания [20–22].

Развитие нанотехнологий ДНК позволило создать индивидуальные предварительно сконструированные наноструктуры с высокой пространственной адресацией.Множество сборок на основе ДНК было исследовано, чтобы служить в качестве платформ для доставки лекарств и генов [23, 24]. С развитием РНК-нанотехнологий в последнее десятилетие произошел взрыв интереса к разработке терапевтических средств на основе РНК, которые рассматривались как третья веха в разработке лекарств [25–27]. В частности, упаковывающая РНК (пРНК) из упаковывающего двигателя ДНК phi29 широко исследовалась как строительная единица для создания структурно упорядоченных наноструктур [28, 29].Следует отметить, что мотив трехстороннего соединения (3WJ) пРНК недавно продемонстрировал беспрецедентные преимущества в качестве системы нанодоставки благодаря своей высокой термодинамической стабильности, программируемости и благоприятным фармакокинетическим и фармакодинамическим профилям in vivo [30–33]. Эти характеристики хорошо иллюстрируются основанными на 3WJ двумерными (2D) терапевтическими платформами доставки [34–36], а также недавно разработанными трехмерными (3D) наночастицами РНК [37, 38]. Наночастицы тетраэдра 3D РНК показывают специфическое in vivo нацеливание на рак с низким накоплением в здоровых органах [38]; Было доказано, что нанопризмы РНК эффективно защищают инкапсулированные полезные нагрузки, такие как малая РНК, от деградации РНКазы [37].Чтобы выполнить обещания контролируемой доставки лекарств на основе РНК-наноклеток для лечения заболеваний, был достигнут точный контроль размера, формы и инкапсуляции груза, в то время как профиль высвобождения груза имеет решающее значение, но остается неконтролируемым [39].

Паклитаксел — химическое вещество, выделенное из коры тиса тихоокеанского ( Taxus brevifolia ) [40]. Как один из наиболее эффективных и популярных химиотерапевтических препаратов против ряда видов рака [41, 42], он вызывает гибель клеток, стимулируя и стабилизируя микротрубочки, а затем останавливая фазы G2 или M клеточного цикла [43].Тем не менее состав с Cremophor EL или дегидратированным этанолом [44] вызывает серьезные побочные эффекты [45] и имеет непредсказуемую фармакокинетику. Поэтому были разработаны альтернативные препараты паклитаксела, такие как системы доставки на основе наночастиц [46, 47]. Например, Abraxane, система доставки на основе наночастиц, состоящая из паклитаксела и альбумина, была одобрена FDA США в 2005 году для лечения метастатического рака молочной железы и немелкоклеточного рака легких. Тем не менее, повышение терапевтической эффективности систем доставки паклитаксела на основе наночастиц остается сложной задачей из-за отсутствия контроля над их профилем высвобождения в месте опухоли.В настоящее время разрабатываются несколько типов платформ для доставки паклитаксела, включая конъюгаты полимер-лекарство [48], неорганические наночастицы [49], наночастицы на основе липидов [50], наночастицы на основе полимеров [51], углеродные нанотрубки [52] и нанокристаллы [ 53] — основанная на нанотехнологиях РНК платформа для доставки паклитаксела с индивидуализированным профилем высвобождения никогда не описывалась.

В этом экспериментальном исследовании мы разработали пирамидальные наноклетки с трехмерной РНК в качестве светочувствительной системы для высвобождения модельного лекарственного препарата по требованию с простотой изготовления и высокой программируемостью.В этом исследовании пирамиды РНК были построены по модульному принципу, в который были включены несколько мотивов РНК для повышения структурной жесткости и стабильности, что привело к однородному размеру и структурно упорядоченным наноструктурам. Фоторасщепляемый (PC) спейсер был вставлен в наночастицу РНК для обеспечения высокоэффективного фотоиндуцированного расщепления. В частности, флуорофор Cy5 или паклитаксел были привязаны к наноклеткам РНК посредством химической конъюгации через спейсер ПК. При облучении ультрафиолетовым (УФ) светом 365 нм конъюгированный флуорофор и лекарственное средство быстро высвобождались (в течение 5 мин). Обработка раковых клеток in vitro наночастицами РНК, содержащими ПК-паклитаксел, показала более высокую цитотоксичность по сравнению с наночастицами РНК без спейсеров ПК. Впервые мы применили стратегию контролируемого высвобождения груза на трехмерных РНК-наноклетках, которая в принципе может быть обобщена на доставку и высвобождение различных биомолекул, тем самым внося вклад в развитие терапии на основе РНК и, возможно, приводя к успешной трансляции в клиника.

2.Результат

2.1. Конструирование наночастиц РНК-пирамиды

Дизайн in silico пирамиды РНК был в первую очередь основан на мотиве 3WJ (запись в Protein Data Bank [PDB] запись: 4KZ2,) пРНК и мотиве четырехстороннего соединения (4WJ) молекула рибозима шпильки () [29, 54]. Сообщается, что пРНК 3WJ, состоящая из трех коротких фрагментов, необычайно термодинамически стабильна, что позволяет использовать ее в качестве строительного элемента для управления образованием более сложных наноструктур [30, 33, 55].Каждый угол пирамиды РНК состоял из модуля 3WJ [30], который был расширен, создавая 4WJ в вершине. Пяти олигонити РНК с 1 по 5 (таблица S1 в дополнительном электронном материале (ESM)) позволили самостоятельно собрать in vitro в реакции с одним горшком в наноклетку пирамидальной формы () с четырьмя треугольными боковыми гранями и одной квадратная нижняя грань состоит из восьми двунитных ребер (вид сверху с последовательностью:). Программа просмотра Swiss PDB и система молекулярной графики PyMOL использовались для выравнивания четырех углов и вершин со спиральной связью РНК.Сборка такой наночастицы снизу вверх в одном горшке была достигнута путем термической денатурации эквимолярных количеств олигонуклеотидов РНК при 85 ° C и медленного охлаждения до 4 ° C (в течение 45 мин). Для получения наночастиц интактной РНК-пирамиды все пять цепей были синтезированы с помощью транскрипции in vitro , а затем смешаны в стехиометрическом соотношении и отожжены в 1 × Трис-буфере в однореакторном режиме для образования комплекса РНК с высокой эффективностью.

Дизайн и характеристика пирамиды РНК.(а) Кристаллическая структура 3WJ пРНК, состоящая из трех ветвей: h2, h3 и h4. (б) Ядро 4WJ, полученное из рибозима шпильки [54]. (c) Схема пирамиды РНК, состоящей из четырех 3WJ в нижней части и одного 4WJ в верхней вершине. (d) Последовательность и 2D структура пирамиды РНК. (e) Нативный ПААГ в 6% геле, демонстрирующий ступенчатую сборку пирамиды РНК. «+» Указывает на наличие прядей. (f) TGGE, показывающий термостабильность и температуру плавления ( T m) пирамиды РНК.(g) Измерение T м пирамиды РНК. (h) DLS-анализ, показывающий размер пирамиды РНК. (i) Дзета-потенциал пирамиды РНК.

Чтобы проверить успешную сборку пирамид РНК, был проведен электрофорез в 6% полиакриламидном геле (PAGE) (). Нити с 1 по 5 добавляли шаг за шагом в 1 × Трис-буфере для сборки с последующим гель-электрофорезом для проверки участия каждой цепи в собранном комплексе. Как показано на, электрофоретическая подвижность в дорожках 1–5 указывает на ступенчатое повышение из-за увеличения доли цепей в комплексе.Меченные флуорофором Cy5 цепи также указывают на включение каждой цепи в наночастицу пирамиды РНК (рис. S1 в ESM).

2.2. Характеристика наночастиц пирамид РНК

Для исследования стабильности собранных пирамид термостабильность наночастиц исследовали с помощью гель-электрофореза в градиенте температуры (TGGE) [56]. TGGE обычно проводят для измерения температуры плавления ( T мкм) больших и сложных структур нуклеиновых кислот.Градиент температуры (30–80 ° C) применялся перпендикулярно электрическому току к 4% нативному акриламидному гелю, с повышением температуры, которое постепенно приводило к диссоциации наноструктур РНК (). Как предполагается, половина частиц осталась неповрежденной при 69 ° C ( T мкм), что указывает на высокую термостабильность наноструктур пирамид РНК. Средний гидродинамический диаметр пирамиды РНК измеряли с помощью анализа динамического светорассеяния (DLS). Как показано в, кажущийся гидродинамический размер пирамиды РНК оказался равным 8.9 ± 0,5 нм. Несмотря на то, что наночастицы пирамиды РНК не имели глобулярной формы, мы предположили, что измеренный размер хорошо согласуется с прогнозируемым размером, учитывая быстрое вращение наночастиц РНК в растворе. Поверхностный заряд пирамиды РНК также определяли, как описано ранее [57]. Поверхностный заряд обычно влияет на склонность наночастиц к агрегации в растворе. иллюстрирует сильно отрицательный заряд пирамиды РНК с единственным пиком при -13.6 ± 0,4 мВ, эффективно предотвращая агрегацию наночастиц. Анионная природа наноклетки РНК также желательна для in vivo приложений, потому что неспецифическое связывание клеток и неблагоприятные взаимодействия с ретикулоэндотелиальной системой могут быть минимизированы [25, 27, 58]. Взятые вместе, результаты PAGE, TGGE и DLS убедительно указывают на образование компактного и интактного комплекса РНК, состоящего из пяти цепей.

Чтобы визуализировать и подтвердить пирамидальную структуру, мы выполнили анализ отдельных частиц с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ).Пирамидальные наночастицы были хорошо распределены, как показано на необработанном изображении (). Кроме того, 2D-проекции реконструированной наночастицы 3D-пирамиды РНК, созданные компьютером, хорошо согласовывались со средними значениями 2D-класса (). Окончательная трехмерная карта пирамиды РНК с разрешением ~ 25 Å была построена из 1103 частиц в EMAN2 (см. Также экспериментальный раздел). Четыре разных изображения наночастицы пирамиды РНК () с поворотом на 90 ° показали структурные особенности, соответствующие предсказанной трехмерной модели, отображаемой на, еще раз подтверждая успешную сборку наноклетки РНК в форме пирамиды.

Крио-ЭМ анализ пирамиды РНК. (а) Репрезентативная необработанная крио-ЭМ микрофотография с отдельными наночастицами пирамиды РНК в белых квадратных квадратах. (b) Репрезентативные проекции и соответствующие средние по классам 3D-модели. (c) Окончательная трехмерная крио-ЭМ карта в четырех видах.

2.3. Конъюгация пирамид РНК с фрагментами РНК, имеющими исходную функциональность

Для разработки потенциальной платформы доставки лекарств, программируемость и универсальность наноносителей имеют решающее значение для включения множественных целевых лигандов и терапевтических модулей без ущерба для их исходных структурных и функциональных свойств [59] .Для включения пяти функциональных модулей на основе РНК, включая аптамеры (такие как малахитовый зеленый [60], шпинат [61], АТФ [62] и стрептавидиновые аптамеры [63]) и рибозим вируса гепатита B (HBV) [64], 5′-конец каждой из пяти цепей был удлинен функциональным мотивом РНК (таблица S2 в ESM), чтобы построить многофункциональную пирамиду РНК, тем самым поместив функциональную группу в центр граней пирамиды (рис. S2 ( а) в ESM). После этого мы провели функциональные анализы для проверки подлинности функций различных модулей (рис.S2 и S3 в ESM). Данные показали, что аптамеры и рибозим HBV, которые были слиты с пирамидой, сохранили свою аутентичную складчатость и функциональные возможности без вмешательства в складывание структуры ядра пирамиды. Это открытие указывает на хороший потенциал этих пирамидальных наночастиц в качестве платформы для доставки многофункциональных лекарств.

2.4. Дизайн и характеристика конъюгатов препаратов ПК с наноклетками пирамиды РНК

Благодаря неинвазивности света по сравнению с другими экзогенными стимулами, мы выбрали источник света в качестве триггера для реализации контролируемого высвобождения лекарств.До закрепления химических препаратов на наноклетках РНК флуорофор Cy5 был оценен как модельный препарат из-за простоты характеристики его высвобождения. Как показано на рисунке, расширенная пирамида была спроектирована на основе вышеупомянутой хорошо охарактеризованной наноклетки путем удлинения нитей 1 и 3 с одинаковыми свисающими концами (Таблица S3 в ESM). Два липких конца, отображаемые на пирамидальной наночастице, были гибридизированы с двумя короткими несущими груз (CC) нитями. Поли-урацил (поли-U) был встроен для обеспечения структурной гибкости свисающих концов.PC-спейсер с о-нитробензильной группой (выделен зеленым в рамке) был включен в короткую несущую груз нить (CC нить и CC-PC нить; Таблица S3 и Рис. S4 (a) в ESM). Модельные препараты были конъюгированы с несущими груз цепями. При облучении УФ-светом 365 нм происходит n-переход внутри о-нитробензильной группы. Возбужденное синглетное состояние переходит в триплетное. Кислород нитрогруппы отрывает протон от метиленового углерода в положении γ-H, и образуется аци-нитрогруппа [65].Впоследствии перегруппировка и расщепление резонансно-стабилизированного пятичленного кольца быстро регенерируют гидроксильную группу на 5′-конце РНК и продуцируют нитрозоальдегид в качестве дополнительного фрагмента на модельном лекарственном средстве, высвобождая его из пирамиды РНК.

Дизайн и конструирование наночастиц пирамиды светочувствительной РНК. (а) Схема пирамиды РНК, конъюгированной с фоторасщепляемым грузом. (b) НАТУРАЛЬНАЯ СТРАНИЦА, созданная с помощью E.B. и каналы Cy5 для демонстрации совместной сборки олигомеров РНК, конъюгированных с Cy5 или паклитакселом, в наночастицы пирамиды РНК.

После синтеза цепей CC и CC-PC с реактивными группами на 5′-конце модельное лекарство было ковалентно конъюгировано с РНК. Для моделирования конъюгации лекарственного средства были применены два различных обычно используемых химического метода биоконъюгации. Для флуорофора Cy5 модификатор амина был присоединен к 5′-концу РНК для мечения посредством реакции сложного эфира NHS, как описано ранее (рис. S4 (b) и S4 (d) в ESM) [66]. Для паклитаксела алкиновая группа была присоединена к РНК для щелчка реакции с азидомодифицированным паклитакселом (фиг.S4 (c) и S4 (e) в ESM). Характеристики мочевины в PAGE подтвердили успешную конъюгацию модельного лекарственного средства с цепями CC и CC-PC с помощью различных методов биоконъюгирования. Мы подтвердили самосборку РНК-наноклеток, содержащих паклитаксел, с или без PC-спейсера с помощью нативного PAGE в 6% геле (). Голая пирамида без удлинительных нитей (дорожка 1) показала более высокую подвижность, тогда как удлиненные пирамидальные наноклетки с свисающими нитями (дорожка 2) проявили более медленную подвижность в геле. Закрепление химических препаратов (дорожки 3 и 4, без или со спейсером ПК, соответственно) или флуорофоров (дорожки 5 и 6, без или со спейсером ПК, соответственно) привело к сдвигу вверх из-за увеличения молекулярной массы наноклеток.

2,5. Характеристика высвобождения модельного лекарственного средства

После подтверждения успешной конъюгации мы охарактеризовали высвобождение Су5 и паклитаксела. После облучения УФ-светом 365 нм Cy5 на цепи РНК со спейсером PC быстро высвобождался в течение 5 минут, тогда как его аналог без спейсера PC не демонстрировал четкого высвобождения флуорофора, как это было характеризовано денатурирующим PAGE (). В фрагменте CC-PC-Cy5 нижняя полоса в канале бромистого этидия (E.B.) указывала на цепи РНК с высвобождением флуорофора Cy5, который был конъюгирован с цепями РНК.Флуоресценция Cy5 в конъюгатах CC-PC-Cy5 также уменьшалась из-за расщепления и высвобождения. Чтобы продемонстрировать индуцированное светом высвобождение химических лекарств, в качестве примера был выбран паклитаксел. Как и в профиле высвобождения флуорофора, более 95% конъюгированного паклитаксела отщеплялось от коротких олигонуклеотидов CC-PC в течение 5 минут после УФ-облучения. Из-за потери конъюгированного химического препарата РНК показала более быструю электрофоретическую подвижность во время денатурирования мочевины в ПААГ (). Напротив, РНК-паклитаксел без спейсера PC не претерпевает заметного высвобождения конъюгированных молекул лекарственного средства.Количественная оценка интенсивности флуоресценции Cy5 в программном обеспечении ImageJ подтвердила высвобождение груза по требованию из нити CC-PC при УФ-облучении ().

Фотоуправляемое высвобождение Cy5 и паклитаксела из цепей РНК. (а) СТРАНИЦА с мочевиной, полученная с помощью E.B. и каналы Cy5, показывающие высвобождение Cy5 из цепи РНК под УФ-облучением. Левая панель: цепь РНК, конъюгированная с Cy5, без PC-спейсера. Правая панель: высвобождение Cy5 в течение 5 мин из комплекса с ПК-спейсером.(b) ПААГ с мочевиной, демонстрирующий запускаемое светом высвобождение паклитаксела из цепей РНК CC и CC-PC. (c) Профили высвобождения Cy5 и паклитаксела из цепей РНК со спейсером PC и без него.

Чтобы проверить профиль высвобождения Су5 из наноклетки РНК в физиологических условиях без какого-либо триггера, мы реализовали самосборку протяженных цепей пирамиды РНК с короткими олигонуклеотидами РНК; эта процедура генерировала наноклетки РНК с двумя свисающими концами, привязанными к Cy5 (). Затем мы инкубировали наноклетки РНК, содержащие Cy5, с 10% эмбриональной бычьей сывороткой (FBS) при 37 ° C в течение различных периодов (0–24 ч).Как показано в собственном геле PAGE (), изображение E.B. канал указывал на интактную пирамиду РНК в течение 24 ч инкубации в 10% FBS. Для обоих типов пирамидных наночастиц не наблюдалось значительной деградации. В канале Cy5 флуоресцентный сигнал от обоих типов пирамид явно не уменьшался, что указывает на стабильное связывание флуорофоров в физиологических условиях, что подтверждается данными количественной оценки (). Это открытие вызывает беспокойство по поводу того, что большинство наноносителей не могут высвобождать груз в физиологических условиях, особенно когда высвобождение по требованию не индуцируется.Чтобы продемонстрировать возможность контролируемого высвобождения флуорофоров из наноклеток пирамидной РНК, использовали УФ-облучение в течение различной продолжительности. Два типа наноклеток РНК имели разные профили высвобождения. И снова E.B. канал для нативного PAGE в 6% геле не показал очевидного уменьшения сигнала, что указывает на интактную пирамиду РНК при УФ-облучении. В канале Cy5 пирамиды РНК со спейсером PC (правая панель, Pyramid – PC – Cy5) давали быстрое высвобождение флуорофоров, о чем свидетельствует снижение флуоресцентного сигнала ().Более 90% Cy5 было высвобождено в течение 5 минут из Pyramid – PC – Cy5, как определено в программе ImageJ (). Поскольку изменение подвижности геля, вызванное высвобождением паклитаксела из наночастиц пирамиды, было незаметным, данные по высвобождению лекарства из наночастиц пирамиды здесь не приводятся.

Сравнение Pyramid – Cy5 и Pyramid – PC – Cy5 в FBS и при УФ-облучении. (а) Нативный ПААГ пирамид РНК, несущих флуорофор Cy5, с (правая панель) или без ПК-спейсера (левая панель) после инкубации с 10% FBS в течение 0-24 часов.(b) Нормализованная интенсивность флуоресценции пирамид РНК, указывающая на стабильность спейсера ПК в FBS. (c) НАТУРАЛЬНАЯ СТРАНИЦА, созданная с помощью E.B. и каналы Cy5, показывающие пирамиды РНК, несущие Cy5 с (левая панель) или без (правая панель) спейсером ПК после УФ-облучения в течение 0–5 мин. (d) Профиль высвобождения Cy5 из пирамид РНК.

2.6. Запускаемое светом высвобождение паклитаксела для лечения

Ковалентное присоединение химиотерапевтических препаратов обеспечивает стабильную клетку и предотвращает неспецифическую диффузию от носителя; однако существуют опасения относительно того, сохраняют ли лекарственные средства, конъюгированные через сшивающий агент, свою биологическую активность.Чтобы проверить цитотоксичность паклитаксела, конъюгированного с наночастицами пирамиды РНК, на клетках рака груди был проведен МТТ-анализ для оценки жизнеспособности клеток после лечения. Наночастицы пирамиды РНК, содержащие паклитаксел со спейсером ПК или без него, вызвали определенную степень ингибирования роста опухолевых клеток без УФ-облучения. Мы ожидали, что цитотоксичность будет вызвана медленным высвобождением паклитаксела из наночастиц РНК из-за внутриклеточной деградации РНК. Цитотоксичность пирамидных наночастиц, содержащих паклитаксел, увеличивалась в зависимости от концентрации.Сами по себе наночастицы пирамид РНК без паклитаксела не обладали очевидной цитотоксичностью, учитывая тот факт, что пирамиды РНК, конъюгированные с паклитакселом, со спейсером ПК или без него, имели аналогичные ингибирующие эффекты на рост раковых клеток (рис. S5 (a) в ESM). Эти результаты предполагают, что как пролекарство паклитаксел сохраняет свою активность после конъюгации с пирамидой РНК и РНК.

Для дальнейшего сравнения высвобождения паклитаксела из пирамидных наночастиц с ПК-спейсером или без него в присутствии УФ-света был проведен анализ МТТ для проверки высвобождения паклитаксела ().И пирамида-паклитаксел, и пирамида-ПК-паклитаксел в концентрации 400 нМ проявляли цитотоксичность после 72-часовой инкубации с клетками MDA-MB-231 из-за присутствия молекул лекарства. Обработка пирамид-паклитакселом без спейсера ПК не показала очевидной разницы в жизнеспособности клеток с УФ-облучением или без него. Напротив, пирамида – ПК – паклитаксел индуцировала более высокую цитотоксичность с помощью УФ-триггера, что указывает на облегченное УФ-излучением высвобождение паклитаксела из пирамидных наночастиц.

Цитотоксическое действие наночастиц пирамиды РНК.Пирамид-ПК-паклитаксел проявлял более высокую цитотоксичность после УФ-облучения, показывая контролируемое высвобождение, тогда как пирамид-паклитаксел без ПК не показывал усиления. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение.

3. Обсуждение

РНК, как уникальный полимер, стала привлекательным материалом для нанобиотехнологии [25, 26, 67, 68]. Несмотря на успех различных систем доставки на основе 2D РНК в исследованиях на животных, разработка наноклеток с 3D РНК для эффективного контролируемого высвобождения груза все еще остается интригующей [37, 38].Стохастическое взаимодействие лиганд-рецептор и неконтролируемое высвобождение лекарства в большинстве систем доставки затрудняют достижение специфической доставки с точным пространственно-временным контролем и контролем дозировки. Здесь мы сообщаем о создании трехмерных пирамидальных наноклеток для РНК в качестве платформы для контролируемого высвобождения лекарств. Было продемонстрировано, что недавно разработанные пирамиды РНК образуют четко определенные и стабильные структуры. Данные DLS и крио-ЭМ показывают, что наноклетки однородны по размеру и имеют предсказанную форму.Кроме того, анализы термостабильности показали, что пирамиды стабильны намного больше, чем требуется 37 ° C для приложений in vivo . Было обнаружено, что контролируемое светом высвобождение паклитаксела эффективно увеличивает цитотоксичность по отношению к клеткам рака молочной железы.

Некоторые технологии лечения рака, которые не позволяют доставлять химиотерапевтические агенты по требованию, могут привести к серьезным побочным эффектам и токсичности, вызванным неспецифической диффузией и высвобождением. Этот феномен подтверждается одобренными FDA препаратами паклитаксела из-за отсутствия контролируемого высвобождения.Впервые мы сконструировали наноклетки с РНК, обладающие способностью реагировать на раздражители, что позволяет контролировать высвобождение их груза, включая паклитаксел. Посредством стратегического позиционирования групп PC o-NB в цепях РНК было продемонстрировано индуцированное светом высвобождение прикрепленных грузов. Под воздействием УФ-света ( λ = 365 нм) ковалентно связанные грузы эффективно высвобождались из наноклеток РНК по требованию и полностью высвобождались в течение относительно короткого периода времени. Хотя УФ-свет может быть непригоден для применения in vivo из-за его плохого проникновения в ткани, источник УФ-света можно заменить менее ослабленным источником света, таким как ближний инфракрасный свет, наряду с использованием двухфотонной фотоактивационной молекулы. .

Эта новая РНК-наноклетка еще больше расширяет сферу применения РНК-нанотехнологий за счет альтернативного механизма доставки по сравнению с ранее наблюдаемым в наночастицах РНК [35, 36]. Хотя необходимы будущие исследования для изучения пригодности меченных паклитакселом РНК-наночастиц для лечения рака, здесь мы представляем доказательство концепции, создав новую терапевтическую платформу с использованием РНК-наночастиц в качестве фотостимулируемого материала. Для приложений in vivo для более длинноволнового источника света могут потребоваться корректировки платформы; однако аналогичные принципы конструкции и конструкции частиц остаются в силе.

Таким образом, мы изготовили новую наноклетку РНК, способную выделять соединения в ответ на УФ-облучение. Было обнаружено, что наноклетки обладают высокой степенью программируемости, что позволяет вмещать большее количество биомолекул, обеспечивая тем самым многообещающую платформу для доставки лекарств в ответ на стимулы. Мы верим, что в ближайшие годы многие инновационные прорывы и открытия продолжатся в развивающейся области интеллектуальных наноплатформ, основанных на РНК-нанотехнологиях, для улучшенной терапии рака.

4. Экспериментальная

4.1. Конструирование, приготовление и самосборка РНК-пирамиды

Молекулы синтетической ДНК были приобретены у Integrated DNA Technologies и амплифицированы с праймерами, содержащими последовательность промотора РНК-полимеразы Т7. Все цепи РНК получали путем транскрипции in vitro амплифицированных ДНК-матриц с использованием мутантной полимеразы T7 Y693F и 2′-F модифицированных нуклеотидов цитозина (C) и урацила (U) с последующей очисткой с помощью 8 М мочевины, 8% денатурирующего PAGE.Эквимолярные концентрации пяти цепей (1 мкМ) смешивали в 1 × Трис-буфере (100 мМ NaCl, 50 мМ Трис, pH 8,0) для восходящей самосборки пирамид РНК. Сборка в одной емкости была достигнута путем нагревания нитей при 85 ° C в течение 5 минут и их медленного охлаждения (в течение 45 минут) до 4 ° C на термоциклере Eppendorf Mastercycle. Затем собранные наночастицы анализировали с помощью нативного PAGE.

4.2. Крио-ЭМ визуализация

Два микролитра раствора наночастиц пирамиды РНК (2 мкМ) наносили на светящийся разряд R1 с размером ячеек 200 меш.2 / 1.3 Сетка Quantifoil. Сетки промокали в течение 1,5 с и быстро замораживали в жидком этане с использованием Vitrobot Mark IV (FEI). Затем сетки были перенесены в криоэлектронный микроскоп JEM2200FS (JEOL), работающий при 200 кВ с энергетическим фильтром в колонке со щелью 20 эВ для скрининга. Микрофотографии наночастиц пирамиды РНК были захвачены камерой 4K × 4K CCD (Gatan) при увеличении 80000 × (что соответствует калиброванной выборке 1,36 Å на пиксель) и мощности дозы ~ 30 электронов в секунду на ² Å. общее время экспозиции 1.5 с. Всего было получено 27 изображений с диапазоном дефокусировки 2–4 мкм.

4.3. Синтез коротких олигонуклеотидов РНК с PC-спейсером и функциональными группами

Синтез РНК проводили в масштабе 200 нмоль на автоматическом синтезаторе олигонуклеотидов. Универсальный стеклянный твердый носитель с регулируемыми порами 1000 Å и стандартные реагенты, включая 2′-F модифицированные РНК-фосфорамидиты, фосфорамидит PC-спейсер (Каталожный № 10-4913-90), 5′-гексинилфосфорамидит (Каталожный № 10-1908-90), и 5′-аминомодификатор C6-PDA (кат.# 10-1947-90) были приобретены у Glen Research. Последовательности коротких олигомеров РНК перечислены в ориентации от 5′-к-3 ‘(«r» обозначает основание 2′-OH, «f» обозначает 2′-F-модифицированное основание, а «PC» обозначает фоторасщепляемое основание. распорка). Для конъюгации флуорофора использовали 5′-аминомодификатор C6-PDA для модификации цепи первичной аминогруппой для реакции с цианином 5 NHS эфиром. Для конъюгации паклитаксела использовали 5′-гексинилфосфорамидит для модификации цепи с помощью алкиновой группы для реакции щелчка с паклитакселом-N3.После синтеза с олигомеров снимали защиту и обессоливали обычными методами. Каждую цепь синтезировали с использованием 2’-фторированного цитидина и урацила. ПААГ с мочевиной в 16% геле был проведен для характеристики синтезированных цепей.

4.4. Высвобождение груза, вызванное УФ-облучением

Портативная маломощная УФ-лампа служила источником света (4 Вт, 0,5 мВт · см ^-2 , облучение при 365 нм) и 10 мкл олигомеров РНК (3 мкМ ) и наноклетки самоорганизующейся РНК (1 мкМ) с или без спейсеров ПК облучали в течение разной продолжительности.Образцы после УФ-облучения хранили на льду в темноте. Образцы олигомеров РНК анализировали ПААГ с мочевиной в 16% геле. Все образцы наноклеток с РНК анализировали с помощью нативного PAGE в 6% геле. РНК- и РНК-наноклетки, меченные Cy5, анализировали с помощью флуоресцентной системы визуализации Typhoon в Cy5 и E.B. каналы. Количественный анализ проводился в программе ImageJ. Ящики равного размера были нарисованы вокруг дорожек, соответствующих квадратным комплексам, и соответствующие количественные значения для каждого гибридного квадрата были разделены на сумму значений, представленных в соответствующей полосе.Графики были созданы в программе Origin 8.0.

4.5. Анализ МТТ

Для определения токсичности наночастиц пирамида-паклитаксел и пирамида-ПК-паклитаксел по отношению к клеткам рака молочной железы MDA-MB-231 был проведен анализ нерадиоактивной пролиферации клеток CellTiter 96 (Promega) для оценки изменений жизнеспособности клеток. Вкратце, 5 × 10 ³ клеток рака молочной железы MDA-MB-231 высевали в 96-луночные планшеты за день до анализа. На второй день наночастицы пирамида-паклитаксел или пирамида-ПК-паклитаксел добавляли в лунки в трех повторностях до конечной концентрации 50, 100, 200 или 400 нМ.Концентрацию паклитаксела рассчитывали как концентрацию наночастиц двойной РНК на основе стехиометрического соотношения. Неконъюгированные пирамидальные наночастицы служили контролем при тех же тестовых концентрациях. Затем планшет инкубировали при 37 ° C в течение 48 часов в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO ₂ . После инкубации в каждую лунку добавляли 15 мкл раствора красителя, и планшет инкубировали при 37 ° C в течение до 4 часов во влажной атмосфере, содержащей 5% CO ₂ .Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора для солюбилизации / стоп-смеси и инкубировали в течение 2 часов. Наконец, содержимое лунок перемешивали, чтобы получить однородно окрашенный раствор, и их оптическую плотность при 570 нм регистрировали на считывающем устройстве для микропланшетов Synergy 4 (Bio-Tek).

Для дополнительной проверки облегченного высвобождения паклитаксела из наночастиц пирамида – ПК – паклитаксел при УФ-облучении для анализа была выбрана концентрация 400 нМ каждого образца РНК после 72 ч инкубации с клетками.В планшете для обработки УФ-светом каждую лунку облучали УФ-светом 365 нм из ручной УФ-лампы в течение 15 мин.

Благодарности

Исследование в лаборатории П.Г. было поддержано грантами NIH R01EB019036, R01CA186100 и U01CA207946 Пэйсуан Гуо. Работа по крио-ЭМ была поддержана грантами NIH P41GM103832 (W. C.) и P50 GM103297 (W. C.). Должность П. Г. Сильвана Дж. Фрэнка, финансируемая Фондом Сильвана Дж. Фрэнка по фармацевтике и доставке лекарств, финансируется фондом CM Chen Foundation. Мы хотели бы поблагодарить Dr.Фарзину Хаку и доктору Даниэлю Ясински за полезные обсуждения. Мы также хотели бы поблагодарить доктора И Шу за синтез паклитаксела-N ₃ .

Примечания

Конфликт интересов

П. Г. является соучредителем ООО «ЭкзонаноРНА». Он также является консультантом Oxford Nanopore Technologies и Nanobio Delivery Pharmaceutical Co. Ltd., а также соучредителем Shenzhen P&Z Bio-medical Co. Ltd и ее дочерней компании US P&Z Biological Technology LLC. Его изобретения в Университете Кентукки были лицензированы Matt Holding и Nanobio Delivery Pharmaceutical Co., Ltd. Его изобретения в Университете штата Огайо были лицензированы для ExonanoRNA LLC.

Электронный дополнительный материал: Дополнительный материал (последовательности РНК, характеристика наночастиц РНК и характеристика конъюгации) доступен в онлайн-версии этой статьи по адресу https://doi.org/10.1007/s12274-018-2174-x.

Ссылки

Расписание приема лекарств

Таблицы лекарств

Наркотики, вещества и некоторые химические вещества, используемые для изготовления лекарств, классифицируются по пяти (5) отдельным категориям или спискам в зависимости от допустимого медицинского использования наркотика, а также его зависимости или зависимости от него. Уровень злоупотребления является определяющим фактором при составлении графика приема препарата; например, препараты Списка I имеют высокий потенциал злоупотребления и могут вызвать серьезную психологическую и / или физическую зависимость.По мере того как меняется список лекарств — Список II, Список III и т. Д., Изменяется и потенциал злоупотребления — наркотики из Списка V представляют наименьший потенциал для злоупотребления. Список лекарств и их расписание находятся в разделе «Планирование в соответствии с Законом о контролируемых веществах» (CSA) или CSA «Планирование в алфавитном порядке». Эти списки описывают основное или исходное химическое вещество и не обязательно описывают соли, изомеры и соли изомеров, сложных эфиров, простых эфиров и производных, которые также могут быть классифицированы как контролируемые вещества. Эти списки предназначены для использования в качестве общих ссылок и не являются исчерпывающими списками всех контролируемых веществ.

Обратите внимание, что вещество не обязательно должно быть включено в список контролируемых веществ, чтобы его можно было рассматривать как вещество Списка I для уголовного преследования. Аналог контролируемого вещества — это вещество, которое предназначено для употребления в пищу человеком и которое структурно или фармакологически существенно схоже или представлено как похожее на вещество Списка I или Списка II и не является одобренным лекарством в США. (См. 21 U.S.C. §802 (32) (A) для определения аналога контролируемого вещества и 21 U.S.C. §813 для расписания.)

Приложение I

Наркотики, вещества или химические вещества, включенные в Список I, определяются как наркотики, которые в настоящее время не используются в медицинских целях и имеют высокий потенциал злоупотребления. Вот некоторые примеры препаратов из Списка I:

героин, диэтиламид лизергиновой кислоты (ЛСД), марихуана (каннабис), 3,4-метилендиоксиметамфетамин (экстази), метаквалон и пейот

Приложение II

Наркотики, вещества или химические вещества, включенные в Список II, определяются как наркотики с высоким потенциалом злоупотребления, употребление которых может привести к серьезной психологической или физической зависимости.Эти препараты также считаются опасными. Вот некоторые примеры препаратов из Списка II:

Комбинированные продукты, содержащие менее 15 миллиграммов гидрокодона на единицу дозировки (викодин), кокаина, метамфетамина, метадона, гидроморфона (дилаудид), меперидина (демерола), оксикодона (оксиконтина), фентанила, декседрина, аддералла

Приложение III

Наркотики, вещества или химические вещества, включенные в Список III, определяются как наркотики со средним или низким потенциалом физической и психологической зависимости.Потенциал злоупотребления наркотиками Списка III меньше, чем у наркотиков Списка I и Списка II, но больше, чем Списка IV. Вот некоторые примеры препаратов из Списка III:

Продукты, содержащие менее 90 миллиграммов кодеина на единицу дозировки (тайленол с кодеином), кетамин, анаболические стероиды, тестостерон

График IV

Наркотики, вещества или химические вещества, включенные в Список IV, определяются как наркотики с низким потенциалом злоупотребления и низким риском зависимости. Вот некоторые примеры препаратов из Списка IV:

Ксанакс, Сома, Дарвон, Дарвоцет, Валиум, Ативан, Талвин, Амбиен, Трамадол

График V

Наркотики, вещества или химические вещества Списка V определяются как наркотики с более низким потенциалом злоупотребления, чем Список IV, и состоят из препаратов, содержащих ограниченные количества определенных наркотиков.Препараты Списка V обычно используются в противодиарейных, противокашлевых и обезболивающих целях. Некоторые примеры наркотиков Списка V:

препарата от кашля с содержанием кодеина менее 200 миллиграммов или на 100 миллилитров (Робитуссин АС), Ломотил, Мотофен, Лирика, Парепектолин

Список контролируемых веществ в алфавитном порядке

Первая таблетка, напечатанная на 3D-принтере, открывает мир лекарств для скачивания | Дизайн

Когда архитекторы печатают дома из кускового пластика, модельеры печатают платья необычной формы, а пищевые компании печатают сомнительно выглядящие гамбургеры, шумиха вокруг 3D-печати часто может показаться новинкой.Но новости о том, что первое в мире лекарство, напечатанное на 3D-принтере, только что было одобрено, говорят о том, что, помимо персонализированных пластиковых безделушек, технология еще может многое предложить.

Спритам леветирацетам, разработанный фармацевтической компанией Aprecia из Огайо, представляет собой новый препарат для контроля припадков, вызванных эпилепсией. Утвержденный Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США на этой неделе, он использует технологию торговой марки ZipDose, которая использует 3D-печать для создания более пористой таблетки.Его структура означает, что таблетка растворяется быстрее при контакте с жидкостью, что значительно упрощает проглатывание больших доз, чем обычную таблетку.

Процесс 3D-печати также позволяет более плотно упаковывать слои лекарств в точных дозировках, что указывает на будущее более персонализированной медицины. Таблетки, напечатанные на 3D-принтере, могут быть заказаны по индивидуальному заказу, исходя из конкретных потребностей пациента, а не на основе подхода, подходящего для всех.

«Последние 50 лет мы производили таблетки на фабриках и отправляли их в больницы», — сказал д-р Мохамед Альбед Алхнан, преподаватель фармацевтики в Университете Центрального Ланкашира.«Впервые этот процесс означает, что мы можем производить таблетки гораздо ближе к пациенту». Внося небольшие изменения в программное обеспечение перед печатью, больницы могли корректировать дозы для отдельных пациентов, а процесс персонализации в противном случае был бы чрезмерно дорогим.

По словам Марвина Рорика, невролога из Riverhills Neuroscience в Цинциннати, технология пористых таблеток также может иметь важные преимущества для других лекарств. «По моему опыту, пациенты и лица, осуществляющие уход, часто испытывают трудности с соблюдением режима лечения», — сказал он.«Независимо от того, имеют ли они дело с расстройством глотания или с ежедневной борьбой за то, чтобы заставить ребенка принимать лекарства, соблюдение режима лечения может стать проблемой. Возможность принимать лекарства в соответствии с предписаниями, особенно для детей и пожилых людей, очень важна для лечения этого заболевания ».

Хотя 3D-печать уже применяется в других областях медицины — от печати новых челюстных костей при реконструкции лица до зубов нестандартной формы и других зубных имплантатов, а также изготовления индивидуального протезирования — это первый раз, когда технология была одобрена для производство лекарств; и это будет не в последний раз.

Исследователи из фармацевтического факультета Университетского колледжа Лондона разрабатывают технику 3D-печати таблеток различной формы, от пирамид до пончиков, используя технику, известную как «экструзия горячего расплава». Различные формы, которые было бы трудно изготовить с использованием стандартных производственных технологий, выпускают лекарства с разной скоростью. Их исследования показали, что скорость высвобождения лекарства зависит не от площади поверхности, а от отношения площади поверхности к объему. Например, пилюля в форме пирамиды высвобождает лекарство медленнее, чем куб или сфера, что позволяет контролировать абсорбцию.

В то время как таблетка Spritam аналогичным образом использует 3D-печать в первую очередь для изменения физической структуры таблетки, другие исследователи работают над тем, как эту технологию можно использовать для разработки новых лекарств на молекулярном уровне. Профессор Ли Кронин из Университета Глазго работал над «химическим компьютером», своего рода химическим набором для 3D-печати, который можно запрограммировать на проведение химических реакций и производство различных молекул. Описывая процесс как аналогичный тому, что Apple сделала для музыки, он представляет себе мир, в котором пациенты смогут загружать «рецепты» лекарств и распечатывать их дома.Он предлагает, чтобы в будущем мы не покупали лекарства, а только чертежи или приложения.

Мышление вне пирамиды

Саймон Гейсфорд, читатель по фармацевтике и глава фармацевтического факультета Университетского колледжа Лондона (UCL) проявляет большой интерес к концепции 3D-печати твердых лекарственных форм. Ранее в этом году Гайсфорд и его команда использовали 3D-печать, чтобы придать планшетам геометрический вид. Группа создала несколько форм, которые сложно изготовить с использованием традиционных технологий изготовления таблеток, включая куб, пирамиду, цилиндр, сферу и тор (1) — они даже экспериментировали с таблетками в форме животных.Но проект не был о создании странных и чудесных геометрических фигур просто для развлечения; Таблетки разной формы имеют разные профили высвобождения лекарств и могут быть полезны для персонализированной медицины. Пирамида растворялась быстрее всех, а цилиндр — медленнее всего — высвобождение лекарства зависело не от площади поверхности, а от отношения площади поверхности к объему.

«С помощью 3D-печати можно печатать планшеты любого размера и формы, а минимальный производственный цикл — один», — говорит Гайсфорд.«Это означает, что мы можем (i) исследовать влияние геометрии на скорость высвобождения лекарств, что было невозможно раньше, (ii) конструировать многослойные или многогранные таблетки (например,« поли-пилюли ») и (iii) действительно рассмотреть парадигму персонализированных лекарств, в которой доза или комбинация доз могут быть адаптированы к пациенту ».

Группа использовала FDM для изготовления таблеток слой за слоем. Гайсфорд считает, что этот тип печати особенно подходит для фармацевтического производства, потому что полимерные волокна могут быть смешаны с лекарством (ями) с помощью экструзии горячего расплава.«Разработка пригодных для печати нитей из фармацевтически приемлемых полимеров была одной из проблем», — говорит Гайсфорд. «3D-принтеры были разработаны для быстрого прототипирования и поэтому обычно печатают твердые инженерные полимеры, не растворимые в воде. Получение экструдированной смеси полимер-лекарство также было трудным. Также было бы хорошо печатать быстрее (в настоящее время для изготовления таблетки требуется 5–10 минут) и проводить анализы на месте для подтверждения того, что разложения лекарства не произошло и что доза верна.В остальном технология, вероятно, уже достаточно развита для коммерческого использования ».

Вначале Гайсфорд говорит, что первоначальной областью применения таблеток такого типа будут препараты с очень узкими терапевтическими индексами, и где есть реальная выгода от адаптации доз для пациентов. В идеале полимеры, пригодные для печати, должны быть одобрены GRAS (обычно считаются безопасными), а активное вещество уже будет на рынке — хотя возникнут проблемы с проверкой дозы на месте производства, а также с безопасностью и эффективностью, которые следует учитывать.После этого можно было бы сосредоточиться на составах для биофармацевтических препаратов и геномной медицины. Эстетика таблеток необычной формы может иметь и другие эффекты, но Гайсфорд допускает, что некоторые формы могут оказаться бесполезными на практике. «Основное преимущество состоит в том, что скорость высвобождения лекарства может быть« отрегулирована ». Из наших первоначальных экспериментов мы видим значительные различия в скорости высвобождения, от 90% высвобождения лекарства менее чем за 2 часа до 90% высвобождения лекарства более чем за 10 часов. Это та же матрица планшета, только другая геометрия », — говорит он.«3D-печать может быть использована для создания многослойных таблеток, которые создают профили контролируемого или отсроченного высвобождения».

Продолжая проект, Гайсфорд и его группа стремятся разработать более быстро растворяющиеся полимеры, пригодные для печати, и исследовать стабильность систем. Он основал компанию FabRx для коммерциализации 3D-печати для фармацевтического производства.

Создание отличных научных журналов — это не только предоставление знаний и высококачественного контента; речь идет также о том, чтобы изложить их правильными словами, чтобы убедиться, что кто-то действительно вдохновлен темой.